棉酚衍生物ApoG2抗人淋巴瘤细胞作用及其作用机理研究.pdf

棉酚衍生物ApoG2抗人淋巴瘤细胞作用及 作用机理的研究 专 业 肿瘤学 博士生 孙健 导 师 姜文奇教授 中 文摘要 【研究背景与目的】 恶性淋巴瘤是原发于淋巴结和其他器官淋巴组织的恶性肿瘤，是造血系统恶 性疾病之一，也是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一。恶性淋巴瘤的病因，包 括病毒感染、环境因素、化学因素等，目前倾向于多种因素作用的结果。 现已知抗肿瘤药物多是通过诱导细胞凋亡而清除肿瘤细胞的。Bcl．2基因家 族是细胞凋亡的重要调控基因，所编码的蛋白通常被分为抗凋亡蛋白(如Bcl．2 细胞，并对恶性淋巴瘤的发生和发展起着重要的作用。Bcl．2蛋白的活性受其Bax 因子，鉴于Bcl．2和Bcl．xL蛋白对于抑制肿瘤细胞凋亡中所起的重要作用，人们 尝试将其作为肿瘤治疗分子靶点。 Mcl．1蛋白是一类，与-Bcl．2蛋白质具有35％的同源性的蛋白质，Mcl．1在许多 细胞凋亡过程中表达下调，Caspase介导的对Mcl．1的分解可能是其表达下调的主 要原因。研究表明Mcl．1在B细胞非何杰金淋巴瘤(B．NHL)中表达上调，并且 与B．NHL的恶性程度呈正相关，Mcl．1主要表达于高度恶性组，在低度恶性组中 为弱表达或阴性表达。因此Mcl．1在B．NHL的发生、发展以及生物学行为中具有 重要作用。凋亡缺陷可以导致恶性肿瘤的发生和发展，转基因小鼠Mcl．1过表达 导致淋巴瘤发病率增加，表明Mcl．1可以直接导致恶性肿瘤的发生。Mcl．1在人类 恶性肿瘤细胞广泛表达，越来越多的研究表明Mcl．1在临床疾病中是一个有效的 预后预测指标。为难治性肿瘤的治疗开辟了一条新途径。提供药物干预的靶点， 可开发研制抗肿瘤新药。所以Mcl．1是未来新的抗癌治疗策略中一个新的靶点。 棉酚是非甾体男用口服避孕药物，研究发现棉酚除具有抗生育、抑制寄生生 物体生长和抗病毒(包括HIV病毒)的作用外，还具有抗肿瘤作用。 有关棉酚抗肿瘤作用的报道，其中涉及对黑色素瘤、结肠癌细胞、Ehrlich腹 细胞等多种细胞具有增殖抑制或抗转移活性。临床试验也已证实棉酚对转移性肾 上腺肿瘤，神经胶质瘤和难治性转移性乳癌具有疗效。 荧光偏振技术的研究发现棉酚具有结合Bcl一2$1Bcl．xL蛋白的能力，为避免两 个醛基带来的非特异性毒性，设计合成-jApoG2，ApoG2已被证实可以有效地与 Mcl．1SEIBcl．2蛋白结合，并具有良好的稳定性，可以对抗酸，碱，光照和过氧化 物。由于ApoG2是全新改造的化合物，有关的ApoG2用于抗肿瘤研究尚未有报道， 将ApoG2用于恶性淋巴瘤的研究在国内外也属于空白，因此是一个崭新的领域。 本研究的目的是：将ApoG2用于恶性淋巴瘤细胞的研究。研究ApoG2体外对 外抗淋巴瘤细胞的增殖作用，并研究其诱导淋巴瘤细胞凋亡的机理。 【方法与结果】 的表达； 提取细胞总蛋白，进行蛋白定量，western 表达。 细胞均有表达。 增殖活性； 方法：取对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板，设ApoG2不同的浓度及相应 值)。 结果：ApoG2对以上5种淋巴瘤细胞均有增殖抑制作用，显示出良好的抗 9．82±0．87I．tM。 进一步检测了不同作用时间下ApoG2对U937细胞的生长抑制作用的影响， IC50值分别为30．08±0．569M，14．81±1．76“M和9．26±1．769M。 第三章： ApoG2对U937细胞周期及相关的细胞周期调控蛋白的影响； 3．1流式细胞仪检测细胞周期分布 方法：收集不同浓度ApoG2处理的U937细胞，采用流式细胞仪检NDNA的 含量，LYSIS软件分析。 阻滞，呈剂量依赖性。 3．2 Western blot法检测细胞周期调控蛋白的表达情况 uM 量蛋白进{?SDS．PAGE电泳，按常规转印及封闭，分别标记一抗，二抗，暗室中 曝光，冲片。 Ill 结果： (1) P21蛋白表达量与对照组相比呈升高趋势，于24h表达升至最高，48h的表