人参皂甙肠道代谢物IH-901抗肝癌分子靶点的研究.pdf

摘要 摘要 肝癌(hetatocellularcarcinoma，HCC)是一种恶性程度高、浸润和转移性 强，治疗难度大的恶性肿瘤，至今仍无有效抗肝癌药物。人参(Panax C． ginseng A．Meyer)是我国传统名贵中药，具有明显抗肿瘤效果，其主要活性成分为人 参皂甙。最新药理学研究表明，人参发挥抗肿瘤作用的最终活性物质不是天然 人参皂甙，而是其一系列肠道菌代谢产物。其中，人参皂甙肠道菌代谢物20．O． K)为 天然二醇组人参皂甙肠道细菌最终代谢产物，是人参皂甙抗肿瘤作用的最终主 要活性形式之一。然而，迄今为止，有关IH．901抗肿瘤的分子机制及其作用的 分子靶点仍知之甚少。 本论文首先采用植物化学方法，选用五加科人参属植物三七块根为原料， 分离获得天然二醇组人参皂甙，然后参照人参皂甙肠内菌代谢机理，借助酶工 程技术，首次分析比较了六种酶在体外酶法转化二醇组人参皂甙制备IH．901的 效果，筛选最佳转化酶。结果表明，其中蜗牛酶转化能力最强，正交实验优化 酶解反应．其最佳转化条件为：物料比为6／1、反应时间9h、反应温度为45℃、 pH值为3．0，酶解得率达到54．24％。为进一步得到高纯度IH．901，采用硅胶柱 行结构和纯度鉴定。结果表明，纯化产物即为IH．901，其纯度大于98％。 为研究IH．901抗肝癌的药效学功能效应，我们通过MTT法检测显示IH．901 株MHCC97．H均有明显的浓度和时间依赖的细胞增殖抑制效果。进一步通过细 33258和AO／EB 胞形态学观察，琼脂糖凝胶电泳DNA片段化分析，Hoechst 细胞核染色及流式细胞仪细胞周期分析等方法观察到IH．901能明显诱导肝癌 过比较研究表明，IH．901对肝癌细胞株的体外细胞毒性和凋亡率均明显高于正 常人肝癌细胞株Chang．1iver。 为了阐明IH．901诱导肝细胞SMMC7721凋亡的分子机制和药物作用靶点， 我们首先研究了IH．901对线粒体凋亡信号通路的激活情况。研究显示，在 摘要 C从线粒体释放到 IH．901的作用下，线粒体跨膜电位(△Vm)明显下降，Cyt 要的介导细胞凋亡的信号通路，我们发现IH．901也能上调FasL和Fas的表达。 信号通路也密切相关，推测该二条信号通路在IH．901诱导的细胞凋亡中可能存 在着相互交叉放大作用，共同执行着细胞凋亡信号转导通路的网络式调控。另 外，通过对凋亡相关蛋白研究表明，IH．901能上调促凋亡蛋白Bax和P53蛋白 的表达，而对抑凋亡蛋白Bcl．2、Bcl．XI，没有影响。推测在凋亡网络通路中，下 游Caspase活化的一个可能的机制是通过P53促进产生细胞周期阻滞，使细胞 发生DNA修复或凋亡。P53是促凋亡蛋白Bax转录因子，P53表达的增加导致 f的释放， 促凋亡蛋白Bax的表达，Bax通过调节线粒体膜的通透性，促进Cyt 从而促进细胞的凋亡进程。 为进一步探讨IH．901对肝癌细胞侵袭转移及血管生成的抑制效果及其作 用的分子靶点。首先，体外研究表明，IH．901能有效的抑制人脐静脉内皮细胞 ECV304的增殖，使其细胞周期阻滞在G0／G1期，诱导其凋亡。进一步研究发 现，IH．901对ECV304的黏附和迁移能力也有明显的抑制作用。其次，通过一 系列细胞侵袭转移的细胞学实验表明，IH．901体外可明显抑制肝癌高转移 MHCC97。H细胞的黏附、迁移和侵袭。在分子水平上，IH．901可抑制肝癌细胞 MMP．9和VEGF的表达。进～步裸鼠体内实验，IH．901能明显抑制高转移肝 和VEGF在裸鼠荷肝癌组织中的表达，且与MVD密切相关。以上结果表明， IH．901不仅具有抑制肝癌细胞侵袭转移的功能，而且在抑制血管形成方面