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RT-PCR及实时定量PCR技术原理 定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。 PCR技术: PCR概念的提出 1983，Kary Mullis 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 特定DNA片段 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高温。 Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process… thermus aquaticus Taq DNA多聚酶的发现 1988年Saiki 等从温泉（?Hot?spring）中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点： ①耐高温， ②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。 ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。 酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的发现使被PCR广泛应用。 在?1989?年，Science?将PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分子?(Molecule?of?the?year) 1、PCR技术的基本原理 在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环的反应过程,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。 一、PCR技术的基本原理和工作方式 ①94℃变性 ② 50-65℃退火 ③72℃延伸 2.PCR反应过程： 20-40个PCR循环 PCR扩增原理 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 ①模板：单链或双链DNA ②引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 ③DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 ④底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) ⑤ Mg2+： DNA聚合酶的激活剂 3.PCR基本要素 4.PCR反应程序 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） ⑵94℃ 30’’ 变性 ⑶50-60℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） ⑷72℃ n’(按1’扩增1kb计算）延伸 ⑹72℃ 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） ⑺4-10℃ 保存 ⑸ 25-35个循环 1）复性和延伸温度 复性的温度是 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60℃ 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定（低于Tm 值2-3 ℃ ）。 延伸温度绝大多数设定为 72℃ 。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR 。 2）反应时间 变性一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。 复性时间有 30 秒种一般是足够的。 延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。 3）循环次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为 25～35 次。 ????平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低 ，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。 总体积 50-100 ?l ①缓冲液 ②dNTP（底物） ③引物 ④模板 ⑤DNA聚合酶 ⑥H2O补足体积。 4、反应体系