山东大学细胞生物学试验方法.ppt

第二章 细胞生物学研究方法 细胞生物学的研究方法归纳起来大体上可划分为四大类： 形态观察、生化分析、生理检测、实验性操作技术。 第一节 细胞形态结构的观察方法 光学显微镜（light microscope ） 电子显微镜（electron microscope） 扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscope） 普通显微镜最大放大倍数1000－1500倍 因为它的分辨率有限，再放大也是空放大 分辨率（resolution）：能将物体相近两点分辨清楚的距离极限 D代表分辨力：D= 0.61? / N.A. ?代表光波波长；N. A. 为镜口率，也称数值孔径（Numerical aperture)。 N. A. =n ? Sin ? /2 n：物镜与标本间介质的折射率；（1或1.515） ?：镜口角（聚光焦点对物镜镜 口的张角，180o） 显微镜的几个光学特点： 介质折射率越接近镜头玻璃的（ 1. 7 ）越好。 sin α /2的最大值小于1； 普通光线的波长为400~700nm，光镜分辨力约为0.2μm，人眼的分辨力为0.2mm，因此显微镜的最大有效倍数为1000X。 （二）紫外线显微镜（ultraviolet microscope） 根据光学原理，光源光波越短，显微镜的分辨本领越大。紫外线显微镜以紫外线为光源，分辨率可提高一倍。 可看到在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。 可用来测定细胞中的核酸含量。 透镜：石英、萤石（CaF2)、碳酸锂等制作。 价格昂贵，使用受限。 （三）荧光显微镜（fluorescent microscope） 20世纪40年代在紫外线显微镜基础上发明。 原理：细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射也可发荧光。荧光显微镜对这类物质进行定性或定量研究。 结构：在普通光学显微镜上添加一些附件： A.光源：通常采用超高压汞灯或氙灯，由它发出各种波长的光。 B.滤片：根据性能分为两组。 一组是激发滤片，作用是仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其它光都吸收掉。 二是阻断滤片，安装在物镜后，作用是吸收和阻挡激发光进入目镜，以免干扰荧光和刺伤眼睛；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。 敏感性高，主要用于细胞结构和化学成分等的研究。 （四）暗视野显微镜（dark field microscope） 原理：显微镜加装特殊装置，使直射光不能进入物镜，只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜 特点：视野的背景是暗的，样品是的边缘是亮的。 特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野光阑 能见到小至5nm的质点，分辨率比普通显微镜高40倍。有些细胞器如核、线粒体亦可见。 能够看到正在运动的微小物体（如精子），也能看到不运动的及某些不能被染色的脂粒，因而常用于微生物与胶体化学研究。 （五）相差显微镜（phase contrast microscope） 相差显微镜由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 原理：将透过标本的可见光的光程差（也就是相位差）变成光强差（即振幅差），从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。 构造： 聚光器或光源上安装环状光阑（annular diaphragm)； 在物镜中加了环形相板(annular phase plate)。 光阑的作用：使透过聚光器的光线形成空心光锥，聚焦到标本上。 光线透过标本发生衍射，偏离了未透过标本的光线线路，波长延迟1/4 ?。 相板作用：相板上有一环形区制成凹槽或凸起，器深度可使通过此区的光线提前或延迟1/4 ?。 主要用于观察活细胞或活组织，是体外细胞和组织培养工作的重要工具。 （六）微分干涉差显微镜（differential interference contrast (DIC) microscope ） 1952年，Normaski在相差显微镜原理的基础上发明。 能显示结构的三维立体投影影像。 （七）激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope） 用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像。 由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描