小茎尖培养结合热处理脱除樱桃ACLSV和PNRSV的研究.pdfVIP

摘 要 本研究以甜樱桃((Prunus.aviuinL.)品系6-7,6-3和三倍体杂种樱桃Gisela5(P. cerasusXP.canescens)为试材，首先通过对影响樱桃小茎尖培养的若干因素的研 究，建立了樱桃茎尖培养的快繁体系。初代培养取休眠芽和生长的茎尖，流水冲洗 1-2h，经70%的乙醇表面消毒 15-30S和0.1%的升汞消毒5-1Omin后，无菌水冲洗 5次，在超净工作台上取 0.5-1.0mm 的小茎尖接种于 WPM 基本培养基并附加 BAO.5mg/l,IBAO.2mg/l和GA30.2mg/l,6-7,6-3和Gisela5的成活率分别为100%, 91.6%和 100%。继代培养采用MS和F,;培养基交替使用并附加BA1.Om酬、 IBAO.2m岁1，同时研究了蔗糖浓度、培养基pH值对增殖的影响。试验结果表明，外 植体在附加蔗糖2-3%,pH值为5.2-6.0的培养基上均能较好的生长，基本无玻璃 化、茎尖枯顶和坏死现象。以F,;生根培养基为基本培养基，采用L9(34)正交试验设 计，系统地研究了影响樱桃生根和移栽的因素。结果表明，培养基附加IBAO.7mg/l 和NAA1.0mg/l,18d后平均生根率达70%以上，根粗壮、二次根发达，炼苗后栽入 蜓石中成活率达90%以上。 在建立樱桃小茎尖培养体系的基础上，进行了热处理结合小茎尖培养脱除 ACLSV和PNRSV的研究。将试材在 38℃下处理3周，取0.5-1.0mm的小茎尖培 养，充分扩繁后，病毒检测结果为:热处理试管苗结合小茎尖培养 (处理 1)，三 个品种均接种小茎尖 50个，6-7,6-3和 Gisela5分别成活 16,24和 30个，无 ACLSV茎尖分别为4,7和3个，脱毒率分别为25.0%,29.2%和 10.0%;无PNRSV 茎尖分别为7,11和9个，脱毒率分别为43.8%,45.9%和30.0%。热处理盆栽苗结 合小茎尖培养 (处理2)，6-7和6-3两个品种分别接种小茎尖25和20个，分别成 活24和 16个，无ACLSV茎尖分别为9和5个，脱毒率分别为37.5%和31.3%;无 PNRSV茎尖分别为 14和 10个，脱毒率分别为 58.3%和 62.5%。单独取小茎尖 0.5-1.0mm (处理3)得到的茎尖培养物经检测极少脱除病毒。综合来说，方法2的 脱毒率显著高于方法 1，方法 1又优于方法3，这说明单独使用小茎尖培养很难脱除 核果类果树ACLSV和PNRSV病毒，而热处理与小茎尖结合则可以较好地解决这个 问题。 对组织总RNA的提取方法进行了改进，使提取时间缩短至3h以内，这种方法 更适合于樱桃幼嫩叶片和试管苗RNA的提取，操作简单，提取的RNA完整性好， 含量和纯度达到了RT-PCR检测病毒的要求，每个样品可节约 1元。以含有病毒的 材料为对照，按照病毒外壳蛋白基因的一段保守序列设计引物，经RT-PCR反应 后，电泳可观察到带有ACLSV和PNRSV的株系分别含有358bp和449bp的特异片 段，而无病毒株系则没有特异带产生. 关键词 樱桃;无病毒;小茎尖培养;热处理 StudiesonEliminationofACLSVandPNRSVbyCombining MeristemTipCulturewithThermotherapyinCherry Abstract Thesweetcherry(Prunus.aviumL.)varieties6-3,6-7andGisela5(P.cerasusX P.canescens)werechosenasmaterialsinthisstudy.Afterseveralfactorsincluding medium,genotypeandhermonewerestudied,themicropropagationsystemofcherrywas obtained.Dormantbudsandcurrentshoottipswereusedasexplants.Formeristem initiationculture,explants(1-2cm)werewashedwithwater(1-2h)andthenplacedin 70%ethanolfor15-30S,0.1%HgClfor5-10min,then,rinsed5-6timeswithsterilled water.Merist