人类精子高质量RNA提取方案的优化.pdf

实用医学杂志2013年第 29卷第 21期 3589 · 检 验 与 临 床 · 人类精子高质量 RNA提取方案的优化 于艳 管群 张斌 闻姬 杨丽霞 菅福琴 杨伟娜 孙伟 摘要 目的：人类精子所含 RNA极少量，且 由于精子中圆形细胞存在，使得分离精子 RNA具有一定的 挑战性。本研究旨在优化人类精子 RNA的提取方案。方法：利用40％的单层梯度液及精子洗涤液纯化精 子．使用TRIzol试剂和 RNeasyMiniKit提取RNA，反转录精子 RNA，以cDNA为模板扩增 PRM2、c．Kit、 CD45、CDH1基 因来确定所提精子 RNA 中是否存在基 因组DNA或体细胞 RNA的污染。结果：利用 3倍体 积的40％单层梯度液及精子洗涤液可以完全去除精液中体细胞的污染，利用TRIzol试剂提取 RNA 比 RNeasyMiniKit更有效。结论 ：人类精子 中含有微量RNA，此方法既经济又有效 ，可以提取高质量的精子 RNA．为人类男性生殖 的功能基 因组研究奠定基础 关键词 精子 ： RNA； 男性不育； 功能基因 Anoptimizingprotocoltoisolatehighlypurifiedhumansperm RNA YUYua，GUANQun，ZHANGBin， WEN “．YANG Li．xia。J1AN Fu—qin。YANG Wei—na，SUN Wei．ReproductiveMedicalCenter，TheSecond HospitalAffiliatedtoShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250001，China Correspondingauthor：SUN Wei E—mail：sunwei996@126．com A【bstract】 Objective Theis01ationofspermatozoalRNAisanchallengeduetothesmallquantityof RNA inspermandthesomacellsintheejaculate．Thestudywastofindanoptimizingprotocoltoisolatehuman spemr RNA．Methods Spemr wereseparatedfromsomaticcellsbycentffugingejaculateswithasingle—layer 40％ gradientsystem andspemr cleaningfluid． Sperm RNA wereisolatedwithTRIzolreagentandRNeasyMini Kit． AmplificationofPRM2， c—Kit， CD45， CDH1genesbyRT—PCR wasusedtoverifythecontaminationof genomic DNA orsomaticcellRNA． Results SomatiCceilsin spemr could becompletelyeliminatedbytriple volume single—layer40％ gradientsystem and spemr cleaningfluid treatment． Sperm RNA isolation wasmore efficientwithTRIzolreagentthanwithRNeasyMiniKit．Conclusions MicroamountofRNA ispresentinhuman sperm ， andhighly—qualityRNA can beisolated byaboveprotocol， whichprovided afoundationoffunctional genomicstudyonmanfertility． K【