大蓟抗肿瘤成分的筛选及用机制研究.pdf

大蓟抗肿瘤成分的筛选及其作用机制的研究 专业：遗传学 研究生：刘素君 指导老师：杨志荣 大蓟为菊科管状花亚科菜蓟族蓟属植物Cirsium DC．的干燥地 japonicum 上部分或根，多年生草本，高100--150cm，茎直立，密被白毛，叶互生；叶片 倒卵状长椭圆形，边缘具浅裂和斜刺，被毛；5—6月开花，头状花序顶生，花 单生，紫红色，瘦果扁椭圆形，生于山野路边，以全草和根入药，我国大部分 地区有分布。全草灰绿色，大蓟性凉，味甘、苦、归心、肝经，功效为凉血止 血、祛瘀痛，主治吐血、衄血、尿血、血淋、血崩、带下、肠风、肠痈、痈疡 肿毒、疗疮、高血压及肝炎等。其化学成分复杂，主要含有黄酮、黄酮苷，挥 发油、三萜和甾酵等物质。大蓟在民间验方多用于治疗癌症，如：大蓟根、三 白草根治肝癌；鲜大蓟叶与鸡蛋清搅拌后贴于患处，可治乳腺癌等。赵鹏等用 大蓟提取物对Hep细胞毒性的研究表明：大蓟提取物能抑制Hep细胞的生长， 并能提高Hep荷瘤小鼠的免疫功能等。但对其抗肿瘤成分及其抗肿瘤机制未见 报道。 ． 本论文以大蓟为研究材料，应用药物化学、分析化学、生物技术、药理学、 细胞学、分子生物学等方法，通过有机溶剂提取、硅胶层析和凝胶层析，以H22 和$180为肿瘤模型筛选大蓟的抗肿瘤活性成分，并从免疫和诱导调亡方面探明 其抗肿瘤机制，为抗肿瘤新药的开发及大蓟的利用提供科学依据和理论基础。 以H22和$180为肿瘤模型，用大蓟水提物、醇提物和乙酸乙脂萃取物等抑 制肿瘤的生长，乙酸乙脂萃取物的抑制作用最明显，其抑瘤率为40．42％。紫外 图谱和特征显色鉴别出大蓟中抗肿瘤的活性成分主要为黄酮类成分，以芦丁为 对照品，用紫外分光光度计测定其总黄酮的含量为65．89％。 用硅胶柱分离大蓟中的黄酮类成分，得到两个黄酮单体，并用紫外、红外、 质谱等光谱分析，确定两个黄酮单体分别为柳穿鱼叶苷和5，7二羟基．6，4’． 二甲氧基黄酮，再以S180为肿瘤模型比较大蓟总黄酮及两个单体化合物的抗肿 瘤作用，结果表明大蓟的两种黄酮混合物抗肿瘤作用强于两个单体化合物。 为探明大蓟总黄酮的抗肿瘤作用与机体免疫的关系，以H22和S180为肿瘤 模型，研究大蓟总黄酮对肿瘤小鼠的免疫器官指数、溶血素、脾细胞转化率及 NK细胞活性等方面的影响，结果表明大蓟总黄酮和两个黄酮单体均能提高免疫 功能的胸腺指数、脾指数和溶血素水平，促进脾细胞转化率及增强Nl(细胞活性。 但大蓟总黄酮的作用强于两个单体化合物，尤其以50mg／ml为最佳，与模型组 比较差异极显著(}PO．01)。表明大蓟总黄酮的抗肿瘤作用是通过提高机体的 免疫功能来实现的，并且总黄酮作用强于单个化合物，两个单体化合物在机体 中的抗肿瘤作用是相互促进的。 脂糖凝胶电泳和DAPI染色对大蓟总黄酮诱导癌细胞的凋亡进行研究，结果表 琼脂糖凝胶电泳表明，实验组细胞可见清晰的DNA“梯子”(Ladder)，呈剂量依 赖性，而空白组细胞不见DNA“梯子”。DAPI染色后在电镜下观察发现，实验 组癌细胞有明显的凋亡小体，故认为大蓟总黄酮可能是通过诱导肿瘤细胞调亡 来实现抗肿瘤作用的。 以研究大蓟总黄酮对肿瘤小鼠IL—l、IL一2和肿瘤坏死因子的影响，从分子 水平上探明大蓟总黄酮抗肿瘤免疫的机理。通过提取给药组和空白组脾细胞和 腹腔细胞的总RNA，采用具有高灵敏度的逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)技术从 肿瘤小鼠脾细胞和腹腔细胞中检测细胞因子IL_l和IL一2的mRNA的表达。结果 表明，大蓟总黄酮具有促进IL一1和IL-2mRNA表达的作用。 利用正交实验优化大蓟总黄酮的提取工艺，并用HPLC测定总黄酮中各黄酮 的含量，其色谱条件为流动相A为PH=3．0的磷酸溶液：流动相B为甲醇。梯度 bin3096 min 洗脱，O～8 A～50％A：8～4060％A。流速0．76mL／min，二极管阵 列检测器检测。紫外检测波长280hm。并分别准确吸取柳穿鱼叶苷及5，7二羟 uL注入高效液相 基—6，4’一二甲氧基黄酮对照品溶液2、4、6、8、