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中国试剂网 3.13.10.2 活体电穿孔法介绍 1、什么是活体电穿孔 活体电穿孔法(in vivo electroporation) 是将外源基因通过电场作用，导入动物目 标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用, 并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面 产生疏水或亲水的微小通道 105～115 μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后 自行恢复。在此期间生物大分子如 DNA 可通过这种微小的通道进入细胞 。近 年来活体电穿孔法用于转基因研究的报道不断增多,在基因治疗方面的优势也日 趋显著,是一种很好的活体基因导入方法。 活体电穿孔法可用于检测瞬时表达系统中载体的表达状况。大量的研究表明活体 电穿孔法在基因治疗方面有非常好的应用前景。因此目前国内外对活体电穿孔法 介导外源基因转移的研究越来越多。 2 、活体电穿孔的法的特点 活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面: 首先,靶器官的选择面广,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器 官。 在用于基因治疗方面，要考虑到靶器官组织生理特性。如果所选择的局部组 织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说 已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。当使用组织特异性 表达载体时,研究人员应根据所构建的表达载体来选择基因转移和表达的靶器官 组织。例如鱼精蛋白 21 启动子可指导外源基因在精母细胞中特异性表达, 以小鼠 的睾丸作为靶器官将含有鱼精蛋白21 启动子的表达载体导入,获得外源基因的表 达量远远高于该基因在肝脏和骨骼肌中的表达。 其次,对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几 KB 或十几 KB 的表达载体, 到 100～200KB 的YAC 、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道。 此外活体电穿孔法操作简单快速, 电穿孔的时间只有几秒钟,而且 DNA 片段不需 要特殊的纯化操作。 但电穿孔法也存在一些的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基 因导入后最快可在 215 小时有表达,但大多 1～2 月后表达量降至很低。外源基 中国试剂网 3.13.10.2 因表达的时间主要由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而 存在巨大差异。 由于应用不同的表达载体,Muramatsu 在小鼠肝脏进行电穿孔 7 天后则检测不到 外源基因的表达,而 Heller 21 天后还可以检测到外源基因的表达。如果选择代谢 和酶活动旺盛的组织器官如肝脏,则表达持续时间会较短,表达时间在 1 个月以 内,但以骨骼肌为靶组织,表达可持续 15 个月。 3、 活体电穿孔法与其他活体基因导入方法的比较 到目前为止,非病毒载体的活体基因导入方法有直接注射法、脂质体法、基因枪 法、电穿孔法等。每一种方法都有其各自的特殊性,因此很难将这几种方法进行 简单的比较。 直接注射法：可将外源基因直接注射到靶位点或血管中,但此种方法不适合以肌 肉作为靶器官,它的外源基因表达效率极低,仅为电穿孔法的百分之一。 脂质体法：活体基因转移法中脂质体法更适宜较大面积组织的基因导入,但无法 避免 DNA 浓度变低,在出血的情况下会使本来不高的 DNA 浓度更加降低,往往造 成基因导入效率低。 基因枪法：适合于 DNA 较易接触到的质地较坚韧的组织如皮肤,而视网膜、胚胎 和禽类的胚盘等组织会由于机械刺激和出血造成器质性损伤或发育停滞,因而不 能用基因枪法完成。DNA 包裹的金属颗粒从基因枪发出到达组织表面大多只几 百微米的距离,较深层的组织不易操作, 表达效率也较低。 Muramatsu 报道在材料一致的情况下, 电穿孔法的基因导入和表达效率明显高于 其它方法,而且电穿孔法适合多种组织的操作[3 ] 。 4 活体电穿孔法施加条