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基因的图位克隆 要点 1. 克隆基因的意义 2. 基因克隆的常用策略及比较 3. 图位克隆的基本程序和以 xa13为例介绍图位克隆的详细过程 5. 总结及展望 1.为什么要克隆基因？ 克隆基因有助于我们解释基因的生物学功能、调控模式、进化关系等。 在植物中，大部分基因的功能未知。 应用价值： 第二次绿色革命、预设育种等故事向我们展示了可以通过分子标记辅助，利用基因进行作物的遗传改良的光明前景。 2.基因克隆的策略: 正向遗传学与反向遗传学 反向遗传学：依赖于从基因组和表达序列标签测序或基因表达谱等的信息，对候选基因的功能进行干扰，从而证明特定序列所控制的表型。 正向遗传学：从已有的相对表型的差异开始，去分离引起表型变化的对应核苷酸序列改变。 基因克隆的主要方法： T-DNA标签法：当T-DAN导入植物基因组中，并插入基因的编码区或重要的调控区，即会发生缺失突变的表型，而且会在插入位点一个标签。 基因的抑制表达：通过降低目的基因在细胞的表达水平，使基因的功能下降甚至消失，来研究基因的功能。 基因的超量表达：通过人为的重组DNA手段，在生物体细胞中大量地、持续的表达目的基因，使目标基因的功能得到超常发挥。 3. 图位克隆和以 xa13为例介绍图位克隆的详细过程 原理：在减数分裂︱时期，同源染色体之间配对，非姊妹染色单体发生交换，与目标基因距离越远，发生交换的频率就越大，距离越近，发生交换的频率就越小（遗传学第三定律）。（王亚馥，戴灼华. 遗传学.1999，第三章：60-76）与基因发生最小交换频率的两侧分子标记，就是与基因最紧密连锁的分子标记，这两个分子标记之间的区段就是包含这个基因的目标区段。 常用概念： 分子标记：基因组特定区域在亲本之间有多态性的DNA序列，简单说，就是这段DNA序列能够指示基因组特定区域的片段是来自哪个亲本 标记基因型：指这段DNA序列所来源的亲本基因组区段 基因基因型：控制目标性状的DNA区段 4. 以xa13为例介绍图位克隆的详细过程 群体准备：选择目标性状差异大的两个亲本构建F2群体。 步骤 第一步:构建分子标记为基础的遗传连锁图 目的：找到与目标基因紧密连锁的两个分子标记。 方法1：对受到多基因控制的数量性状基因或想要定位多种性状的基因，需要构建全基因组的遗传连锁图。 方法2：对想要定位一个质量形状或效应特别大的数量形状基因，也可以通过BSA法构建局部遗传连锁图 BSA法：在一个利用F2、BC 、RIL、 DH等群体中随机选择一定数目的某种表型如抗病的个体，提取DNA,构成一个抗性池；再随机选择一定数目的另一种表型如感病的个体，提取DNA组成感病池。这样，抗病池和感病池基因组除了在抗病性位点有差异(有多态性)，在其它位点都是一样的(无多态性）。因此，在抗病池和感病池之间有多态性的标记就是与目标基因连锁的标记。 G. Zhang et al等利用IR24和IRBB13杂交，得到的F2分离群体，利用BSA法，找到了一个RAPD标记OPAC05，在抗病池和感病池之间有多态性。从而将 xa13定位于OPAC05附近。 第二步：构建包含目标基因的物理图谱 用目标区段内的最紧密连锁的两侧的分子标记作为探针筛选文库，再以分离到的克隆的两端作为探针进一步筛选文库，如此往复，直到确认克隆之间的重叠关系, 最终构建覆盖目标基因的两个标记之间的物理图谱。 目的：通过对确认的克隆测序测序等进一步开发与目标基因连锁更加紧密的分子标记实现染色体登陆。 现在，对于水稻、拟兰芥等已经测序的植物，无须进行物理图谱的构建。对其它的没有完成测序的作物，因为基因组共线性在植物界广泛存在，物理图谱的构建也变的容易了。 第三步：精细定位 扩大F2群体，用紧密连锁的两侧质量好的分子标记对3000-10000个单株将基因定位到较小的区段定位到单基因甚至几百bp。 先用目标区段两侧的两个质量好标记对大群体进行重组单株的鉴定，利用这个区段开发出来的标记，对重组单株进行标记基因型的分析，所有鉴定出的重组单株上收获的F3代种子，来鉴定基因型是纯合的还是杂合的，结合标记基因型和基因的基因型把目标基因定位到更小的区段 利用极端隐性个体计算重组率：c=(N1+N2/2)/N N为纯隐性基因型个体总数，N1为标记基因型为纯合且此位点来自显性亲本的隐性表型个体总数，N2为标记基因型为杂合的隐性表型个体总数