启动子克隆方法的研究进展.docVIP

启动子克隆方法研究进展随着基因工程的发展，常常需要构建一种能高水平表达异源蛋白质的表达载体。启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件。因此研究启动子的克隆方法，对研究基因表达调控和构建表达载体至关重要。 迄今为止，国外尚未见到有关启动子克隆方法的综述性报道，国内仅孙晓红等曾就启动子的结构、分类、克隆方法和食用菌中已经分离到的启动子作过综述。而近年来又有许多改进的克隆启动子的方法获得了多方面的成功，本文就近年来改进的启动子克隆方法作一综述，以期促进对启动子分离技术的应用。 1　启动子克隆的几种方法 1.1　利用启动子探针载体筛选启动子 　　启动子探针型载体是一种有效、经济、快速分离基因启动子的工具型载体，包含2个基本部分：转化单元和检测单元。其中，转化单元含复制起点和抗生素抗性基因，用于选择被转化的细胞；检测单元则包括1个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因以及克隆位点。 　　利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。 　　当插入段同时满足(1)具有基因启动子序列；(2)具有翻译启始区；(3)具有启始密码子；(4)插入方向正确；(5)插入片段3端编码区序列抗性基因编码区读码框一致，则有可能形成有功能的抗性融合基因，从而启动抗性基因的表达。 　　最早由Rachael等在大肠杆菌中以四环素抗性基因作为报告基因构建了启动子探针质粒pBRH3B，并克隆了一些原核和真核启动子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作为报告基因，Fodor等以大肠杆菌LacZ为报告基因，构建了酵母启动子探针质粒并克隆了一些启动子片段。构建启动子探针型载体，较为常见的检测标记基因有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、四环素抗性基因(Tet)和卡那霉素抗性基因(Kan)。近年来，人们渐渐较多地使用潮霉素B磷酸转移酶(hph)基因作为检测标记基因。李维等曾构建了含有hph抗性基因的启动子探针型载体pSUPV8，直接在大肠杆菌中分离黄孢原毛平革菌基因的启动子。先用Sau3AI酶切黄孢原毛平革菌基因总DNA，再与用BamHI酶切后的pSUPV8相连，转化大肠杆菌，用间接筛选法从氨苄青霉素和潮霉素抗性平板上筛选重组子，得到6个双抗重组子(pCH1～pCH6)，电泳检测插入片段分别命名为CHl～CH6；再用原生质体转化法将重组子分别转化黄孢原毛平革菌，对获得的转化子进行复筛，仅pCH6的转化平板上有稳定生长的菌落，说明了CH6片段在黄孢原毛平革菌中具有启动基因表达的功能。该方法不需要知道具体基因的序列，可随机筛选启动子，避免了引物设计，能获得大量的启动子片段。 1.2　利用PCR技术克隆启动子 　　即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。 　　苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5启动子序列的引物，以水稻叶绿体DNA为模板，PCR扩增出16SrRNA基因5启动子区的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位点，构建测序载体质粒pZ16S，进行序列测定，结果表明所克隆的片段长为144bp，含有SD序列。同源比较结果表明，所克隆的片段与水稻叶绿体16SrRNA启动子序列具有100％的同源性。 上述的PCR方法简便、快捷、操作简单，是人们较为广泛使用的技术。 1.3　环状PCR 　　环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这2种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。 1.3.1 I-PCR I-PCR是1988年由Triglia最早提出的一种基于PCR的改进的染色体步行方法。I-PCR的实验程序包括，基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物(流程如图1所示)。 韩志勇等以I-PCR技术为基础克隆了转基因水稻的外源基因旁侧序列。先用小量法提取转基因水稻的总DNA，总DNA用10倍过量的限制内切酶进行过夜酶切，酶切片段进行自连接，然后根据工程质粒的T-DNA区设计2对反向引物，进行套式PCR扩增旁侧序列。建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序列的技术体系。在1周内克隆了35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在300～750bp之间。I-PCR