光合细菌分离方法的优化的研究.docVIP

光合细菌分离方法的优化研究 摘要:以污水处理厂污泥中光合细菌为材料，对其进行了分离方法的优化。采用半固体试管法、双层平板涂布法、平板稀释分离法、Hungate 滚管法、双层平板划线法对光合细菌进行了分离试验研究，比较各分离方法的优缺点。 关键词:光合细菌; 分离方法; 厌氧; 优化 光合细菌( Photosynthetic bacteria，PSB) 广泛分布于淡 水、海水、极地或温泉( 包括高热水体) 以及高盐、高有机 质含量等不同的生态环境中，是一类进行不产氧光合作 用、具有复杂代谢功能的微生物。它能利用多种基质，可 以异养、自养或兼性营养; 存在着好氧、厌氧和兼性厌氧 类型 ［1］ ，具有较强的分解有机物特性，作为净化剂和饲料 广泛应用于水产养殖和畜禽养殖 ［2 ～5］ 。 光合细菌属于水圈微生物中的一类，大部分 PSB 是 从土壤、水沟和污泥中分离得到。由于 PSB 在厌氧条件 下更易生长，且分离技术要求高，很难富集并分离到活性 高的光合细菌。对光合细菌的多种分离方法进行比较， 分析不同分离方法的效果。 1 实验材料和方法 1. 1 样品来源 光合细菌采自污水处理厂污泥，经富集培养，分离纯 化，获得红假单胞菌属的光合细菌。 1. 2 培养基 富 集 培 养 基: CH 3 COONa 3． 0 g; CH 3 CH 2 COONa 0． 3 g; NaCl 1 g; ( NH 4 ) 2 SO 4 0． 3 g; MnSO 4 25 mg; K 2 HPO 4 0． 3 g; KH 2 PO 4 0． 5 g; CaCl 2 0． 05 g; MgSO 4 ·7H 2 O 0． 2 g; FeSO 4 ·7H 2 O 0． 005 g; 酵母膏 0． 1 g; 蛋白胨 0． 01 g; 蒸馏 水1 000 ml; pH 7． 0 ［6］ 。 分 离 培 养 基: CH 3 COONa 3． 0 g; CH 3 CH 2 COONa 0． 3 g; NaCl 0． 5 g; NH 4 Cl 1 g; MgSO 4 ·7H 2 O 0． 2 g; K 2 HPO 4 0． 3 g; KH 2 PO 4 0． 5 g; CaCl 2 0． 05g; MnCl 2 ·4H 2 O 0． 003 g; FeSO 4 ·7H 2 O 0． 005 g; 酵母膏 0． 1 g; 蛋白胨 0． 01 g; 谷氨酸 0． 0002 g; 蒸馏水 1 000 ml; 琼脂 20 g; pH 7． 2 ～ 7． 4; 121 ℃ 高压灭菌 30 min。 R 培养基: CH 3 COONa 3． 0 g; NaHCO 3 1． 0 g; NH 4 Cl 1． 0 g; K 2 HPO 4 0． 5 g; MgCl 2 0． 2 g; FeCl 2 -EDTA 0． 005 g; NaCl 5． 0 g; 抗氧化剂 0． 25 g; 琼脂粉 8 g; 蒸馏水 1 000 ml， pH 7． 4 ± 0． 2; 121 ℃ ，灭菌 15 min。 1. 3 制备样品稀释度 以无菌操作取25 ml 样品，放入装有225 ml 无菌水的 灭菌三角瓶内，混匀。用 10 ml 的灭菌移液管准确吸取 10 ml的样品匀液放入装有 90 ml 稀释剂的三角瓶，混匀， 制成 1∶ 100 的样品液，依此类推，将菌液稀释至 10 － 6 ， 10 － 7 ，10 － 8［7］ 。 1. 4 分离方法 1. 4. 1 半固体试管法 取光合细菌不同稀释度 0． 5 ml 或 1 ml 于试管，迅速 倒入灭菌后的 R 培养基 20 ml( 温度为 50 ℃左右) ，待凝 固后上层覆盖 5 ml 1% 灭菌纯琼脂。同时用稀释剂做空 白对照，于光照培养箱培养 ［8］ 。 1. 4. 2 双层平板涂布法 取光合细菌不同稀释度 0． 5 ml 和 1 ml 菌液，在已经 置备好无冷凝水的装有分离培养基平板上均匀涂布，同 时上层覆盖分离培养基保持厌氧。室温放置 1 h，用封口 膜封口，30 ℃，1 500 ～2 000 lx 光照强度下厌氧培养 ［9］ 。 1. 4. 3 平板稀释分离法 取光合细菌不同稀释度0． 5 ml 和1 ml 菌液与已熔化 并冷却至 50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾人灭过 菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平 * 收稿日期:2011 －03 －07 基金项目:辽宁省科技攻关项目( 2005229003) ; 辽宁省科技厅项目(232) ; 辽宁大学“211”三期重点学科资助项目 作者简介:徐成斌( 1980 － ) 男，汉族，辽宁省大连市人，讲师，主要从事环境微生物学研究。E-mail: xuchengbin80