第六讲 酶和细胞固定化.ppt

第三章 酶和细胞的固定化 Chapter 3 immobilized enzyme and cell 酶的催化具有高选择性、高催化活性、反应条件温和、环保无污染等特点。但游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入底物等物质，纯化困难，不能重复使用。 历史简介 1916年Nelson和Griffin首先发现了酶的固定化现象，从此科学家就开始了固定化酶的研究工作。1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸，开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。 已经显示固定化酶将在现代酶工程以及整个生物工程中占有重要作用，它在应用上和理论上的巨大潜力引起了生物化学、微生物学、医学、化学工程和高分子等领域的各类研究人员的广泛关注。 主要讲授内容 一、固定化酶(细胞)的制备 二、固定化酶(细胞)的性质和指标 三、固定化酶和固定化细胞的反应器 四、酶工程在医药工业中的应用 一、固定化酶(细胞)的制备 1. 传统的酶固定化方法 2. 新型的酶固定化方法 3. 固定化细胞的方法 4. 固定化酶常用的载体材料 1. 传统的固定化酶的方法 传统的固定化酶的方法为载体结合法，大致可分为： 吸附法 交联法 包埋法 其他方法 载体结合法 载体结合法是将酶结合于不溶性载体上的一种固定化方法。根据结合形式的不同，可分为物理吸附法、离子结合法和共价结合法三种形式 。 物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电作用等。 物理吸附法的优缺点 优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小。 缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落，并且污染催化反应产物。 离子结合法 离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂，如DEAE-纤维素、AmberliteCG-50、XE-97和Dowex-50等。 离子结合法的优缺点 离子结合法优点操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，能得到酶活回收率较高的固定化酶。 缺点是载体和酶的结合力较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度较高的条件下进行反应时，往往会发生酶从载体上脱落的现象。 共价结合法 共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价键。 共价结合法的优缺点 共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更加严重。 交联法 交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定化酶。 交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用最广泛的是戊二醛。 包埋法 包埋法是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。该法条件温和，基本上不涉及酶的构象及酶分子的化学变化，因而酶活力回收率较高。 包埋法的缺点 但包埋法固定化酶易泄漏，常存在机械强度差、扩散受限制、传质阻力较大等问题，不宜催化大分子底物的反应。常用的载体主要有明胶、聚酰胺、琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺、光交联树脂、海藻酸钠、火棉胶等。 包埋法可分为两种 ： 网格型 微囊型 将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型，常用的高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物，以及淀粉、明胶、海藻胶和角叉菜胶等天然高分子化合物。 将酶和细胞包埋在高分子半透膜中的称为微囊型，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。 传统的酶固定化方法的缺点： 酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，而且酶的固定化量降低，因此定向固定化酶技术将成为今后固定化酶研究的热点。 2. 新型的酶固定化方法 新型的酶的固定化方法，要在较为温和的条件下进行，尽