拟南芥AtDsbA活性地研究及底物蛋白捕获.pdfVIP

中文摘要 蛋白质二硫键是维持空间结构的重要共价键，二硫键的形成是蛋白质折叠和成熟的 重要步骤，某些蛋白质的活性还可以通过二硫键氧化态和还原态之间可逆转化，实现蛋 白质活性调节。最近在拟南芥类囊体膜上发现了一种新的氧化还原酶，包含2个功能结 构域，其中，膜结构域是哺乳动物维生素K环氧化物还原酶同源类似物，而水溶性结 构域属于硫氧还蛋白家族，与大肠杆菌参与二硫键形成的周质蛋白DsbA在二级结构上 有相似性，我们称之为么仍sbA。为了研究彳fDsbA在叶绿体内的作用机制及其在叶绿 体内的具体功能，本文构建了彳fDsbA的表达载体，进行了原核表达和纯化，在此基础 上研究了彳fDsbA催化蛋白质二硫键转化的作用、与催化作用有关的氨基酸位点并通过 亲和层析捕获了么fDsbA在叶绿体中的可能作用底物。具体结果如下： (1)彳msbA的氧化活性分析。变性的l矾aseA在体外可以自主复性折叠，还原态 促进RNase A的氧化折叠过程，动力学分析表明，彳仍sbA促氧化折叠活性是浓度依赖 性的，说明么，DsbA具有二硫键氧化酶活性。 (2)彳仍sbA的还原活性分析。包含一对二硫键的天然胰岛素可以被低浓度的二硫 速度会大大加快，随着彳msbA浓度的增加，胰岛素被还原的速度也增加，说明彳，DsbA 也具有二硫键还原酶活性。 (3)彳仍sbA的异构酶活性分析。为了检测么国sbA是否具有异构酶活性，首先将 变性的RNaseA用强氧化剂铁氰化钾处理，虽有大量二硫键产生，但RNaSeA活性低， 说明大量的二硫键为错配二硫键。将含有大量错配二硫键的RNaseA在氧化态与还原态 一定比例的谷胱甘肽缓冲液中复性时，彳fDsbA存在下，RNaseA的活性恢复增快，说 明彳，DsbA可以打开错配的二硫键并帮助形成正确配对的二硫键，即彳仍sbA具有二硫 键异构酶活性。 原酶类催化电子转移时往往通过酶分子中巯基与二硫键相互转化来实现，彳，DsbA有4 个半胱氨酸，其中2个半胱氨酸之间相隔2个氨基酸，称为相邻半胱氨酸，另外2个相 问15个氨基酸，那么哪些半胱氨酸直接参与氧化还原反应呢?我们对编码基因进行了 定位突变，经原核表达和蛋白纯化后，测定AtDsbA活性变化，结果两个显示相邻半胱 氨酸突变后，彳国sbA没有变化。 存在于植物叶绿体中，为了检测彳fDsbA可能作用于叶绿体内哪些哪些底物蛋白进而参 并纯化突变体蛋白后，与叶绿体总蛋白作用，通过亲和层析的方法捕获与彳仍sbA直接 的合成有关的蛋白激酶，而么f捌672D编码蛋白主要与蛋白质的泛素化降解有关。 以通过促进其蛋白质的氧化折叠发挥作用。通过捕获的4国sbA的互作蛋白可知， 4fDsbA可以通过调节基因彳，锣』39D和基因么，2口6刀D编码的蛋白产物而参与代谢。 关键词：4fDsbA；二硫键；氧化还原酶；异构酶；底物蛋白 ll andPotentialof onOxidoreductiveCharacters Studies Targets 彳ⅢsbA Abstract disulfidebondsseⅣeas elementsarldthefo吼ation Regulator)，protein keysi印aling a11dthe reactionsofthedisulfidesare inViVo．IIl reduction specificaJlycatalyzed chloroplaSts， are reducedthedithiol meir by regulato巧disulfidespreferentially oxidant is tobeiden