目的基因导入受体细胞2.ppt

第六章目的基因导入受体细胞 第三节 重组子的筛选 在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子。 概念 克隆子 转化子 重组子 将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子 ），现在这两者有通用的趋向。 含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。 一、遗传表型直接筛选法 （一）根据载体选择标记初步筛选转化子 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为筛选转化子的依据。  一般的做法是: 将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。 选择培养基是： 根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。 选择物： 是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。 （一）根据载体选择标记初步筛选转化子 （1）抗药性筛选 （2）插入失活筛选法 （3）插入表达筛选法 （4）显色互补筛选法 （5）利用报告基因筛选植物转化细胞 （6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 注意： 利用含一种选择药物的选择培养基无法区分重组子和非重组子，只能区分转化子和非转化子。 （2）插入失活筛选法 （3）插入表达筛选法 利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。 有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连接上一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达。 例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片段插入CI基因的Hin dⅢ或BglⅠ位点上时，CI基因失活。Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型。 质粒本身因为Tcr基因受阻碍为Tcs表型，当转化细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。 （4）显色互补筛选法 lacZ 基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。 具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。 lac Z’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lac Z’的重组载体转化lac Z’互补型菌株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落，而lac Z’互补型菌株本身为白色菌落。当lac Z’区插入外源基因后，再转化lac Z’互补型菌株，由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。 此方法主要用于原核生物。 以显色剂x-gal作为选择物时: DNA对照组不应出现任何菌落； 感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色的； 感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应有白色的。 其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。 （5）利用报告基因筛选植物转化细胞 报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。 在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等。 特征 　　作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件： 　　(1)已被克隆和全序列已测定； 　　(2