分子标记实验服务小册子.docVIP

实验服务 1 AFLP 1.1样品收集与运输 样品类型 样品要求 植物材料 新鲜组织、叶片采用硅胶干燥后或干冰运输到实验室 动物材料 新鲜组织，无水乙醇封存低温运输到实验室 DNA 干冰运输到实验室 Amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA 多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点同其以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。PCR为基础结合了RFLPRAPD的分子标记DNA进行限制性内切酶酶切，在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3’PCR扩增，只有那些与3’然后选择特定的片段进行PCR扩增，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，1）DNA提取试剂CTAB沉淀液： 50mmol/L Tris.Cl（pH＝8.0），10mmol/L EDTA, 1%(W/V)CTAB, 20mmol/L巯基乙醇。 2）PCR扩增相关试剂 Taq 酶 （2u/μl） 鼎国自产 dntp (10MM) 鼎国自产 3）聚丙烯酰胺凝胶储液配制（4%） 尿素 152.1g （Sigma） 丙稀酰胺 17.2g （Sigma） 甲叉 0.6g （Sigma） 10×TBE 42ml 定溶到420ml 1.5相关仪器 台式离心机 DGL-16 DG-II暗箱式紫外透箱仪 （鼎国自产） DG-3D大型水平电泳槽 （鼎国自产） DG-III双稳数显电泳仪 （鼎国自产） Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer, USA) Sigma 3K18型低温冷冻离心机（Sigma ,USA） ABI PRISM 377 sequencer 测序仪 1.6 实验结果 1）原始数据 公司为客户提供ABI377测序仪电泳检测后的片段大小，即原始数据。数据是通过GENESCAN这个软件进分析，软件每2个碱基读一次数，Marker片段范围为 70-500bp，这样在70-500 bp之间一共读取216个数，数据表如下图，由于不可避免的误差，在所设置的片段Bin Range范围内的片段，认为是同一条带，例如：在71.5-73.5 之间，c1 、c2扩增条带大小分别为73.00835 和71.9044，这样的误差范围在我们的误差允许范围认为是同一条带。 2）01数据 在原始数据的基础上，有带的地方替换为1，无带的地方替换为0，这样构成了01数据，同时给客户发一份所有01数据汇总后的总数据。 由于软件要求，我们一般都会给客户把数据处理成NTSYSpc2.1 这个软件要求的标准的01数据格式即01总数据。01总数据中 r1-r216 表示第一个引物，r217-r432 代表第二个引物和01分数据一一对应。例如： 一共有8个引物：a-1、a-2、a-3、b-1、b-2、c-1、d-1…….等，在总数据中按顺序排列： R1- r216 的数据为：a-1 这个引物的数据 R217-r432 的数据位：a-2 这个引物的数据……..，以此类推。 3）电泳图 公司为客户提供选扩增的全部电泳图谱，供客户参考 不加内标电泳图谱 加内标电泳图谱 4）聚类图 基于DICE相似系数的UPGMA个体间聚类图 5）相似系数 1.7 常见问题 1）客户委托公司做实验服务，客户需要做哪些工作？ 客户只需提供实验材料，我们负责DNA提取及后续全部试验。收到样品后，我们一般会给客户做预实验，根据客户预实验结果，客户满意度，决定是否安排后续实验。公司现有64个引物组合，全部为FAM荧光标记，我们会从中筛选条带清晰、多态性较好的引物组合给客户。在开始正式实验前，客户需支付课题服务一半的费用，余款在公司给客户发送最后一批数据前，一次结清。 2) 关于AFLP收费价格 目前我们的基本价格是30个样，6~8对引物，6000元，实验周期大约为20天，如果您样品较多或引物组合较多，