微生物限度检查法实验准备.doc

微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30～35 ℃ ；霉菌、酵母菌培养温度为23～28 ℃ 。 检验结果以1g 、lml 、10g 、l0ml 或10cm2 为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量（g 、ml 或cm2）。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100 cm2；要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g 或20ml （其中10g或10ml 用于阳性对照试验）。 检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4 片。 一般应随机抽取不少于检验用（两个以上最小包装单位）的3 倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃ 。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1 小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至1OOml ，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1:10 的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80 ，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 （6）具抑菌活性的供试品 当供试品有抑菌活性时，采用下列方法进行处理，以消除供试液的抑菌活性，再依法检查。常用的方法如下。 ② 离心沉淀法?? 取一定量的供试液，500 转／分钟离心3 分钟，取全部上清液混合。用于细菌检查。 细菌、霉菌及酵母菌计数 计数培养基的适用性检查 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。 菌种?? 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 大肠埃希菌（Escherichia coli[CMCC ( B ) 44l02] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[ CMCC ( B ) 26003 ] 枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis ?) [ CMCC ( B ) 63501 ] 白色念珠菌（Candida albicans ）〔 CMCC ( F ) 98001 〕 黑曲霉（Aspergillus niger) [ CMCC ( F ) 98003 ] 菌液制备? 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18 ～24 小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48 小时。上述培养物用0 . 9 ％无菌氯化钠溶液制成每lml 含菌数为50～100CFU 的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5 ～7 天，加人3 ～5ml 含0.05 % ( ml /ml ）聚山梨酯80 的0.9 ％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80 的0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml 含孢子数50 ～ 100CFU 的孢子悬液。 菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8 ℃ ，可在24 小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2 ～8 ℃ ，在验证过的贮存期内使用。 适用性检查 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌各50～100CFU ，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置30～35 ℃ 培养48 小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100CFU ，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置23 ～28 ℃ 培养72 小时，计数；取白色念珠菌50 ～100CFU ，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基．平行制备2 个平皿，混匀，凝固，置23 ～28 ℃ 培养72 小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定? 若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70 % ，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。 计数方法的验证 当建立产品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数