C4植物PEPC酶的单克隆抗体制备和双夹心ELISA检测方法的建立.pdfVIP

分子植物育种，2015年，第 l3卷，第 1期，第205—213页 MolecularPlantBreeding，2015，Vo1．13，No．1，205—213 技术主题 TechnologyFeature C4植物PEPC酶的单克隆抗体制备和双夹心ELISA检测方法的建立 张斌 张启军： 廖慧敏 0 秦海龙 ，2· 宗寿余z 夏士健z 吕川根 1南京农业大学农学院，南京，210095；2江苏省农业科学院粮食作物研究所，南京，210014 同等贡献作者 通讯作者，rb8@jaas．ac．cn 摘 要 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase，PEPCase)是高等植物尤其是C4植物进 行光合作用的一种关键酶，利用PEPC基因提高C 植物的光合效率具有重要的应用前景。本研究利用来源于 玉米 PEPCase免疫的BALB／c小 鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2／0融合，经筛选克隆，得到 3株能稳定分泌抗 PEPCase的单克隆抗体杂交瘤细胞，并制备腹水型单抗。利用其中一株杂交瘤细胞4E5的小鼠腹水单抗和 PEPCase的兔源多抗，建立检测PEPCase的多抗一待检样品一单抗模式的双夹心酶联免疫吸附检测方法 (enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)。检测条件经过优化后分别为：兔源多抗 以1：3200稀释 ，单抗 4E5以1：800稀释，整个操作过程仅需要 5个小时(不含包被和封闭时间)，本方法能够长期保存 。利用建立的双 夹心ELISA检测方法检测验证转玉米PEPC基因水稻，在经PCR分子检测后证实携带PEPC基因的305株 样品中，有237株为阳性单株，阳性率为77．7o／0，符合率较高。实验表明，本研究能够为育种上快速筛选转 PEPC基因作物提供了一种更加简单、快速、灵敏的检测方法。 关键词 C植物，PEPCase，单克隆抗体，双夹心酶联免疫吸附试验 PreparationoftheMonoclonalAntibodyAgainstC4-PepcaseandEstablish- mentoftheDoubleSandwichELISA DetectionMethod ZhangBin ZhangQijun LiaoHuimin。 QinHailong。 ZongShouyu XiaShijian LvChuangen 1CollegeofAgriculture，NanjingAgriculturalUniversity，Nanjing，210095；2InstituteofFoodCrops，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences， Nanjing，210014 Theseauthorscontributedequallytothiswork Correspondingauthor，rb8 aas．ac．cn DOI：10．132718．mpb．013．000205 Abstract Phosphoenolpyruvatecarboxylase(PEPCase)isakeyenzymeduringphotosynthesisinC4plant．Introd- ucingPEPCgeneintoC3plantisofgreatimportancetoimproveitsphotosynthesisefficiency．Inthisstudy，three positivehybridomascelllinessecretingthemonoclonalantibodies(McAb)againstPEPCasewereobtainedbythe fusingmousemyelomacells(SP2／O)withspleencellsfromBALB／cmiceimmunizedwithPEPCaserfommaize． The4E5McAbandtherabbitpolyclonalantibodywaspreparedandpurifiedto establishthedoublesandwich ELISA fordetecting PEPCase．WeoptimizedtheconditionofthisdoublesandwichELISIA：therabbitpolyclonal antibodyandthe4E5McAbweredilutedinratioofl：3200and1：800．respectively．Only5hourswereenoughofr thewholeprocess(coat