丙型肝炎NSSATP6基因原核表达载体的构建和表达纯化及多克隆抗体的制备.pdf

维普资讯 ． 9 ． 窒 壁病墨壹2008 2月第 11卷第1期 JClinHepatol，Februry2008．Vo1 ． 11．No．1 · 论 著 丙型肝炎 NS5ATP6基因原核表达载体的构建和 表达纯化及多克隆抗体的制备* 郑铁龙 成 军 洪 源 【摘要】 目的 构建丙型肝炎病毒 NS5A蛋 白反式激活蛋 白6基 因的原核表达载体并进行表达 、鉴定 。方法 从 已构建的pGBKT7一NS5ATP6质粒上切取 NS5ATP6基因，再克隆入 pET32a(+)质粒 ，构建 pET32a(+)一NS5ATP6表 达重组体 。结果 以pET32a(+)一NS5ATP6重组体分别转化 DH5a和 Rosseta大肠埃希菌后 ，经 IPTG诱导，pET32a (+)一NS5ATP6表达 出分子量为 41KD左右的重组蛋 白。免疫动物并经 Westernblot检测证实其具有 良好 的抗原性 。 结论 成功地构建 了原核表达载体 pET32a(+)一NS5ATP6，诱导表达和纯化 了NS5ATP6融合蛋 白，并制备 了该蛋 白的 多克隆抗体 ，为下一步该基因功能研究奠定了基础 。 【关键词】 丙型肝炎病毒 Ns5ATP6基因 原核表达 Expressionand purification ofNS5ATP6 fusion protein and preparation of its polyclonalantibodyand identification ZHENG Tielong，CHENGJun，HONGYuan．TheAcademy0l厂M ilitaryMedicalSciences，Beijing857500，China [Abstract] Objective ToconstructprokaryoticexpressionvectorcarryingNS5ATP6geneofhepatitisCvirusand expressitinE．coli．Rosseta．Methods TheNS5ATP6genewascomefrom thevectorpGBKT7一NS5ATP6constructed byourselves．Aftersequencing，thegenewascloned into plasm idpET32a(+ )toconstructrecombinantprokaryoticex— pressionvectorpET32a(+ )一NS5ATP6andtransformedintothecompetentE．coli BL21．AftertheNS5ATP6 protein wasinducedwith IPTG ，itwasanalyzedwithSDSandconfirmedwithW esternblot．Expressedbacteriawerequas— sationedbyultrasoundandanalyzedwith sodium dodecylsulfate-polyacrylam idegelelectrophoresis．Theexpressedproduct waspurifiedandrenaturedbyNi—affinitycolumnchromatography．Then．thepurifiedpET32a(+ )一NS5ATP6fusionpro— teinwasusedtoimmunizeNew Zealandrabbitstogainpolyclonalantibody．Thespecificityandpotencyofpolyclonalanti— bodywereevaluatedbyW esternblotandE