畜禽基因定位方法及研究.doc

畜禽基因定位方法及研究 ? ? 1??遗传图谱的构建 ????基因的精确定位首先依赖于遗传图谱(genetic map)。遗传图谱又称为遗传连锁图谱(genetic linkage map)，是利用多态性遗传标记，通过对参考家系进行遗传连锁分析得到的，反映了遗传标记之间的相对关系。遗传图谱的质量取决于连锁群中的遗传标记的数量、杂合度和均匀分布的程度，遗传标记之间的距离用分摩尔根(eM)表示。从理论上讲，任何一个可观察性状的基因座位都可以在连锁遗传图谱中找到一个与之相连锁的DNA标记。因此。分析畜禽经济性状座位(通常是数量性状座位，QTL)在基因组的位置以及对表型性状的影响，主要都是依赖于遗传连锁图谱。构建遗传图谱的程序大致包括：建立参考家系(reference famiIv)；对参考家系的每一成员组作遗传标记的基因型分析：进行标记间的连锁分析，得出连锁群；绘制遗传图谱。 畜禽遗传图谱的研究始于20世纪80年代末期，进入上世纪90年代以来，美、欧、日等发达国家先后启动了动物基因组研究计划。纷纷投入巨资和庞大的科研力量进行研究。短短10余年的时间，在猪、牛、绵羊、鸡等主要畜禽上取得了巨大的进展。随着动物基因组研究计划的深入开展，各种畜禽更加完善的遗传图谱将陆续被构建出来。 2物理图谱的构建即基因的精确定位 物理图谱的研究旨在将被克隆基因或DNA标记精确的定位于染色体上．对于研究物种进化和位置克隆经济性状基因有着十分重要的作用。基因的物理定位方法通常有体细胞杂交法、荧光原位杂交法、引物原位标记法、系列对比法等。 2．1??体细胞杂交法 在已定位的全部基因中，约有40％的基因是用这一方法定位的。此法可进行基因同线性测定(synteny test）及区域定位。其基本条件是要获得核型相对稳定一致的体细胞杂种克隆，即由若干杂种细胞构成的一套杂种细胞克隆(如猪／鼠)，每个细胞克隆都包含各自不同的染色体组合模式，构建克隆棋盘fclone panel)。研究者把各杂种细胞克隆及所含染色体都列在一个表上。若要对某特定表型对应的基因定位．就可取出这些细胞克隆材料，分析有无有关产物，再与克隆棋盘所列染色体对照，即可确定基因所在染色体。如果要进行基因的区域定位，则必然有一套含有特定染色体结构变异或保留特定染色体片段的克隆棋盘。????利用体细胞杂交法定位猪基因的典型例子是MPI （甘露糖磷酸异构酶)和NP(核苷磷酸化酶)基因的定位研究。Christensen等f1985)利用猪脾细胞和鼠骨髓细胞融合．产生了19种猪，鼠杂种细胞系。通过分析19种细胞的核型和猪的7种酶的存在状况．发现杂种细胞包含全部鼠染色体和极少数猪染色体．而MPI和NP总是与猪的7号染色体同时存在，因此肯定MPI和NP基因位于7号染色体上。Ryttman等(1986)建立了包含24个猪，鼠杂种细胞克隆的克隆分布板(Clone panel)。通过详细的分析研究，进一步证实MPI位于猪的7号染色体上。Ryttman等(1988)利用一涉及到7号染色体相互易位的猪成纤维细胞，建立了包含18个猪／鼠杂种细胞系的克隆分布板。对MPI和NP进行区域定位。由酶与核型对应关系的分析。确定NP位于7q12-qter，MPI位于7q12-pter。 2．2荧光原位杂交法 ????原位杂交(ISH）最早被用于染色体组型和核酸分布的分析，后来，随着技术的发展，它被用于基因染色体定位的研究．特别是非同位素标记技术的发展。使得ISH的应用日益广泛。目前它已被用于肿瘤的细胞遗传改变、人类的早期发育、核与基因组的分子结构、不同种同间的基因图诺比较、动物的细胞发生和无数的基因定位研究。用于基因染色体定位的FISH~被称为C0-FISH或COD-FISH(chromosome orientation and direction FISH)。 ????CO-FISH技术是以生物素或地高辛等半抗原为标记物．采用随机引物法或缺口平移法标记DNA探针，将探针变性后即可用于细胞分裂中期或间期细胞核染色体的原位杂交并产生??DNA-DNA杂交体，这种杂交体可以被与半抗原有高度亲和力的荧光标记分子所检测到，而这种杂交信号又可以被与荧光分子偶联的单抗所放大。此外，DNA探针也可以直接标以荧光分子，这些荧光分子有：FITC、德克萨斯红(texas rod)及最近开发的花青染料(cyanine dyes)等，如果这样，就不需要进行信号检测和放大就可以直接观察DNA-DNA杂交体。用于FISH的DNA底物已经由原先固定的染色体和间期细胞核发展到伸展的单链DNA分子、细胞核及染色体的自然形态等。由于FISH技术已经可以在伸展的DNA分子上进行，这样它的分辨率就达到1～2 kb，并能在此区域内作图。而传统的在细胞中期和间期进行的FISH只能分别分辨