Bmi-1质粒载体的构建.docVIP

Bmi-1基因过表达载体的构建 【摘要】目的：在真核细胞中构建Bmi-1基因的过表达载体。方法：从GenBank中获取Bmi-1基因序列，设计针对Bmi-1的特异性引物，利用PCR方法获得全长目的基因，将目的载体和PCR产物进行双酶切，在T4DNA连接酶下形成重组质粒。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。结果：经阳性克隆测序结果及结果分析，测序正确。结论：人源Bmi-1真核过表达载体构建成功。 【关键词】 Bmi-1；过表达载体；转化 前言：多梳基因( polycomb group genes,PcG)家族是果蝇发育时维持同源异形基因稳定表现的重要因子。在胚胎发育、肿瘤发生和干细胞的维持中有着重要的作用。由荷兰癌症中心于1991年在鼠淋巴瘤中发现的Bmi-1基因( B cell-specific MLV inte-gration site-1 )是多梳基因家族中重要成员之一,参与干细胞的增殖、分化与衰老,在多种肿瘤形成过程中起重要作用[1]。人类Bmi-1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区(该区域被认为与各种白血病染色体易位有关), DNA大小为4. 9 kb, mRNA为3 199 bp,含10个外显子,编码含326个氨基酸的蛋白质,分子质量为36. 9 kD[2]。其蛋白表达在细胞质、染色质或染色体。Alkema等用鼠Bmi-1 cDNA片断作为探针从人白血病细胞中分离出Bmi-1并进行分析,发现其核苷酸序列与鼠的一致性达86 %,所编码的蛋白质的氨基酸系列与鼠的一致性达98 %。Bmi-1基因含有一个环指模序,位于N-末端的环指结构域( ring fin-ger domain, RF),与抑癌基因c-Myc协同在细胞增殖和肿瘤形成中发挥作用。Bmi-1通过环指结构与其他环指蛋白,如dinG等形成异源二聚体,再与其他成分相互结合,抑制其靶基因的转录[3]。Bmi-1基因还含有一个位于中心的保守DNA结合模序螺旋-转角-螺旋-转角(DNAbandinghel-ix-turn-helix-turn motif,H-T-H-T),起转录抑制作用。研究表明,这两个结构在细胞生存期的延长和抑制p16上是不可或缺的,敲除这两个结构, Bmi-1基因即会失活,导致早衰。 材料与方法 实验材料和主要试剂 试剂 1kp DNA ladder Marker来源于Fermentas公司；250bp DNA ladder Marker来源于捷瑞公司；琼脂糖来源于赛百盛公司；限制性内切酶来源于NEB公司；In-Fusion? PCR Cloning Kit来源于clontech公司；Taq polymerase来源于SinoBio公司；dNTP来源于Takara公司；Primer来源于捷瑞生物公司；Plasmid 抽提 Kit来源于Promega公司。 过表达载体构建 以元件顺序为CMV-EGFP-MCS-SV40-Neomycin 的GV144载体酶切，其克隆位点为：XhoI / BamHI。 目的基因片段的获取 用序列为TCCGCTCGAGCTATGCATCGAACAACGAGAATC的引物BMI1(5154-2)-P1和序列为ATCGGGATCCTCAACCAGAAGAAGTTGCTGATG的引物BMI1(5154-2)-P2用于PCR钓取目的基因并进行电泳。 重组质粒构建 将PCR产物连接入线性化真核表达载体，PCR对序列为AATCTAAGGAGGAGGTGA的引物KL5154-P3和序列为gcaatagcatcacaaatttc的引物SV40pA-R进行鉴定，再用PCR鉴定重组克隆。 制备感受态细胞 先配置以下溶液：0.1M CaCl2溶液，以0.22μm过滤除菌；250mM KCl2溶液；2M MgCl2溶液，高压灭菌；SOB: 1ml 250mM KCl2溶液加入100ml LB，以5M NaOH 调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml 2M MgCl2溶液。然后用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，从于37oC培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有 100 ml LB培养基的 1 L烧瓶中；于 37oC剧烈振摇培养 3 小时(旋转摇床，300转／分)；在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置 10分钟，使培养物冷却至 0oC；于4 oC, 以4000转／分离心 10分钟，回收细胞；倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽；以 10 ml用冰预冷的 0.1 mol／L CaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；于4oC，以4000转／分