球孢白僵菌几丁质酶超表达及其双价转基因工程菌株的构建及其毒力评价.pdfVIP

摘要 球孢白僵菌是最常见的虫生真菌之一，其寄主范围广，易大量生产，已开发 为真菌杀虫剂在害虫生物防治中广泛应用。然而，球孢白僵菌和其它虫生真菌一 样，具有杀虫慢的重大缺陷。为此人们一直在潜心研究虫生真菌的分子致病机制， 以寻找可通过基因工程手段进行改造的基因。几丁质酶在虫生真菌穿透寄主体壁 的过程中起一定作用，但其与真菌毒力的关系尚不清楚。本研究将外源的球孢白 僵菌几丁质酶基因Bbchitl分别转入两个出发菌株：含有该基因的球孢白僵菌野 生型菌株RCEF0013，以及将北非蝎(Androctonusaustralis)昆虫特异性神经毒 从而构建成一个双拷贝的几丁质酶超表达转基因工程菌株和一个蝎毒一几丁质 酶双价转基因工程菌株。 本实验首先构建了含有筛选标记bar基因和外源几丁质酶基因Bbchitl的载体 在加入草胺磷(1 00Hg／m1)【l】的SDAY培养基上筛选获得转化子，构建成一个双 法转入含有外源蝎毒基因AalTd的一价转基因工程菌株RCEF0013．A中，在加入苯 在胶体几丁质诱导培养基中酶活最大值高于野生型菌株的4．2倍，从而使该几丁 质酶基因在转化的菌株中得到超表达。 对马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus)进行生物测定的结果显示，超量表 株的毒力。对马尾松毛虫幼虫进行生物测定的结果表明，转化子RCEF0013．C conidiaJml) 降低5．46倍。致死中量(17．6conidia／mm2)比出发株(113．9conidia／rnrn2)减 酶基因超表达的球孢白僵菌双拷贝的工程株的毒力有了显著的提高。转化子 conidia／mg) 丁质酶基因和蝎毒基因超表达的球孢白僵菌双价工程株的毒力有了很大的提高。 与毒力的关系是复杂的，在分泌达到一定阈值后与毒力才有明显的相关关系。 关键词：转基因；蝎毒基因；载体构建；芽生孢子；毒力；马尾松毛虫 Abstract bassianaisoneofthemostCOlTlmon wide BPa“veria entomogenousfungi，with easinessfor hasbeen into host and fungal rangegreat massproduction，anddeveloped m usedmost other has insecticide fungi，however，it widely．Likeentomogenous lethal drawback,slowtime．Consequently，mollecularpathogenic important mechanismofthe hasbeenfocusedinrecent inordertolookfor fungi years to meansof a virulence．related engineering．Chintinaseplays gen