糖原磷酸化酶BB型测定和临床应用及其亲与层析提纯方法的初步探索.pdfVIP

糖原磷酸化酶BB型测定与临床应用 及亲和层析提纯方法的初步探索 硕士研究生： 杨雪松 指导教师： 朱正美 教授 指导小组： 燕秋 教授 专业名称： 生物化学与分子生物学 摘 要 、厂 ＼糖原磷酸化酶(GP)是糖原分解过程的关键酶，在糖类代谢过程中起着 十分重要的作用。在哺乳细胞体内存在三种同工酶：脑型(GPBB)、肌 型(GPMM)和肝型(GPLL)。近年研究发现，GPBB与心肌缺血密切 相关。在正常生理条件下，GPBB在心肌细胞中以GPBB．糖原复合物的 形式与肌浆网紧密结合。心肌缺血时，糖原分解供能使与之结合的GPBB 由结合型变为游离型，此游离的可溶性GPb扩散进入细胞浆，进而由于 细胞膜通透性增加而进入外周血。因糖原磷酸化酶BB型在心肌细胞中 含量高，并在心肌缺血损伤早期(2．3小时)即可释放入血，早于其它的 临床生化指标(LDH、CK-MB、AST、GPT等)，因此认为它极有希望 成为心肌缺血早期诊断的一个新标志物。但由于GPBB在脑中含量很高， 因此，本文除测定心肌缺血患者外还考察有关脑缺血患者的血清GPBB 含量变化，以鉴定血清GPBB对测定的特异性。1 本文建立一种检测GPBB的新的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法一 即应用能特异性识别GPBB某一抗原位点的单克隆抗体(McAb)，建立 的间接夹心ELISA方法。通过对测定条件的优化，确定了包被用McAb 浓度为2斗g／rnl，封闭剂为2％BSA，一抗和酶标二抗的工作浓度分别为1： 800和l：10000．从临床应用出发，本文对所有的相关试剂进行了稳定 性实验，从而确定了各种试剂相应的最佳保存条件：(1)McAb包被： BSA封闭后，4℃放置28天内稳定。(2)一抗：l：800稀释后4C条件 下28天内稳定。(3)酶标：抗：用商品供应的二抗稀释液稀释后4C保 存28天内稳定。 ／ ～～0通过对8l例正常人血清GPBB水平测定，测定结果表明：正常人血 清GPBB参考值范围为0．2202．如．0691，男女之间无差异。此外，还测定 了32例急性心肌梗塞患者、14例不稳定心绞痛患者、35例陈旧性心梗 患者和31例脑缺血患者的血清GPBB水平。结果表明：急性心肌梗塞患 者和不稳定心绞痛患者GPBB值分别为0．4541：I：0．0240和0．6708：1：0．1434， 均高于正常人值，差异显著(po．05)，而陈旧性心梗和脑缺血患者血清 显著性差异(po．05)。 通过ELISA测定方法在临床上的应用的初步探索，我们若要进一步 完善该测定方法，则需要得到较高纯度的GPBB。本文根据以往的相关 文献报道，应用三种亲和层析方法进行分别提纯。结果表明，5-√地位 4B亲和层析及糖原亲和层析二种方法有一定的纯化效果，通 Sepharose 过SDS电泳分析可见94K．D条带，另还有少量其它杂带；而Cu2+ 金属亲和柱法则结果不好，无94KD条带，电泳杂带多。] 目前国外虽已有GPBB测定的相关报道，但在国内尚无此诊断试剂， 本文应用单克隆抗体建立的间接夹心ELISA测定方法，具有特异性高的 优点，从而避免了非特异性反应．应用本法对临床样品测定的结果进一 步表明，GPBB对急性心梗有早期诊断意义，排除了脑损伤对它的影响， 从而为今后该测定方法的进一步发展提供一定的实验基础。 、 斑讯芝竺靴删‘鞔跳体乩18A 亲和层析 4 Detect