农杆菌介导的pCB302-3载体在本氏烟中瞬时表达条件优化.pdfVIP

第 34卷第 3期 华 中 农 业 大 学 学 报 Vo1．34 No．3 2015年 5月 JournalofHuazhongAgriculturalUniversity May2015。8～ 12 农杆菌介导的 pCB302．3载体在本 氏烟中 瞬时表达条件优化 孙春莲 王洪洋 田振东 园艺植物生物学教育部重点实验室／国家蔬菜改 良中心华中分中心／ 湖北省马铃薯工程技术研究中心／华中农业大学园艺林学学院，武汉430070 摘要 以GFP为报告基因构建植物表达载体pCB302—3一GFP，采用农杆菌叶片注射法对其在本氏烟叶片中 瞬时表达条件进行优化。分析基因沉默抑制子p19、菌液不同浓度以及侵染时间对GFP荧光强度的影响，结果 显示，当农杆菌菌液Deoo为0．8～1．0并与含有p19基因的载体共注射条件下，农杆菌注射3～5d后本氏烟草叶 片表现出很强的绿色荧光，实现了GFP在本氏烟草中的高效瞬时表达 。 关键词 pCB302—3载体；瞬时表达优化 ；农杆菌叶片注射；本氏烟；基因沉默抑制子 p19；GFP 中图分类号 Q785 文献标识码 A 文章编号 1000—2421(2015)03一-0008一O5 农杆菌介导的稳定转化技术包括基因超量表达 以实现有效稳定转化 。本研究以pCB302—3为载 和 RNAi干涉技术，是 目前研究基因功能的常用方 体，通过监测绿色荧光蛋 白GFP的表达，在模式植 法。但是稳定转化技术的转化效率及再生效率低， 物本 氏烟 (Nicotianabenthamiana)中优化其瞬时 而且耗时比较长，如果要对多个基因开展功能研究 表达条件，提高蛋 白表达量，以期将其作为植物活体 会耗费大量时间和精力。近年发展起来的基于农杆 免疫共沉淀(inplantacoimmunoprecipitation)的高 菌注射技术 (agroinfiltration)的基因瞬时沉默和瞬 效植物瞬时表达载体。 时表达技术 由于耗时短、可以高通量进行基因功能 1 材料与方法 研究，已成为开展基因功能研究的重要方法_l1]。瞬 时表达 (transientgeneexpression)是指将外源基 1．1 植物材料及菌种 因导入到植物细胞后，作为一种基因组外的遗传物 本 氏烟 (N．benthamiana)种子 由湖北省马铃 质在一定时间内实现转录和翻译并积累相应表达产 薯工程技术研究中心保存。先将种子播种在填充腐 物的技术_3]。该技术已广泛用于基因表达_4]、基因 殖土的蔬菜育苗穴盘上，当幼苗长出3～4片叶子后 相互作用[5]、蛋 白表达[]和疫苗生产[]等方面的研 分苗，移栽到 lOcm×10cm 大小的塑料钵 中。置 究。用于植物瞬时表达的常用载体包括病毒和非病 于 22~24℃ 的培养室中生长 ，18h光照，生长 6周 毒载体。病毒载体主要利用病毒在植物体内的快速 的幼苗用于农杆菌注射实验。 复制实现 目标基因的高效表达_lg_lo]。非病毒载体主 大肠杆菌DH5Q、农杆菌GV3101、含有 p19基 要是农杆菌植物表达载体，利用组成型强启动子驱 因质粒农杆菌菌株 GV3101和pFF19质粒 由笔者 动来实现 目标基因的表达。小型化植物表达载体易 所在实验室保存 。pCB302-一3载体 由英 国邓迪大学 于克隆操作 ，一般不含选择标记 ，常用于植物瞬时表 PaulBirch教授惠赠 。 达研究。pCB302—3载体是 Xiang等In]在 pBIN19 1．2 载体构建 基础上改建的小型化农杆菌植物高效双元表达载 pCB302—3载体基本结构见 图 1，启动子为 体，启动子为CaMV35S，后接 增强子元件，含有 CaMV35S，后接Q增强子元件。多克隆位点MCS2 多克隆位点，质粒大小约 6．5kb，易于克隆操作，可 为 目标基因插入位点。 收稿 日期：2013—1l一3O 基金项 目：国家 “863”项 目(2O13AA1O26O3)；国家 自然科学基金项 目(3117