病毒学研究方法简介.pptVIP

病毒的分离与鉴定 病毒的分离 组织培养 鸡胚培养 动物接种 3. 动物接种 常用动物 小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。 不同病毒对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。 接种途径 按病毒侵袭部位选择相应的接种途径： 乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种 柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种 乙肝病毒 黑猩猩静脉注射 流感病毒 鼻腔滴种 用途 分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清 五、病毒抗原检查 可检测细胞内、外的游离病毒抗原。 敏感、特异，简便、快速。适用于多种病毒性疾病的早期快速诊断。 病毒学研究方法简介 生物安全实验室 P1实验室——研究的病毒危险性较低，试验人员连口罩都不用带，穿上白大褂就可以了，试验人员在这里很放松； P2实验室——研究的是中度危险的病原，像肝炎、流行性感冒等等，要求戴防护性较好的口罩； P3实验室——研究的是高度危险的病毒，传染性很强，而且没有疫苗，试验人员的保护措施要比P1/P2实验室严密得多； P4实验室——全球级别最高的生物安全实验室，研究的是极度危险的病毒，如令人谈之色变的埃博拉病毒、马尔堡病毒，进入这种实验室的工作人员，处于防护服的严密保护之下，连空气都不能在实验室内呼吸，红色螺旋状管子，是专门用来向室内输送新鲜空气的，试验人员一进入实验室，要先屏住呼吸，马上接上这种管子，然后才能呼吸。 根据微生物及其毒素的危害程度不同，分为４级， 一级最低，四级最高。? 病毒学研究的主要方法 生物学特性测定:在宿主上的反应——症状、传播等 病毒分离与培养：提纯与纯化、二元培养法 光镜与电镜观察：病毒粒子和病毒与相应抗血清的特异免疫吸附情况 免疫学技术：以血清学和组织免疫化学方法检测带毒情况、多克隆抗体、单克隆抗体 分子生物学技术：核酸分子杂交、PCR等 一、生物学特性测定 在宿主上的反应 宿主范围、症状表现、传播方式等 病毒的理化性质 病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、 体外存活期等 病毒接种方法 注射接种、病毒组织培养技术 植物病毒——汁液摩擦接种、昆虫介体接种、嫁 接接种、菟丝子接种法等 巨细胞病毒感染细胞的典型“猫头鹰眼”样核内包涵体 冠状病毒感染——“非典” X线胸部检查可见肺部不同程度的片状阴影，少数病人进展迅速，呈大片状阴影，大多数为双侧改变，阴影吸收消散较慢。 TMV transmission by an Apis sp. A severe mosaic symptom on tomato leaf (TMV) 腿色斑Chlorotic spoting 黄化Yellowing 病毒检测 二、病毒的分离与鉴定 提纯extraction/纯化purification 动物接种 组织培养 标本采集 标本处理后接种 鸡胚接种 卵黄囊膜 尿囊液 羊膜腔液 绒毛尿囊膜 观察囊膜病变 血凝试验 血凝抑制试验 CPE EM 包涵体 空斑试验 红细胞吸附 中和试验 观察发病 抗原检测 抗体检测 病理检查 病毒的提纯是将宿主中的病毒粒子与宿主细胞组分区分开来的过程。 原理是利用病毒的蛋白质和大分子粒体的特性，及其与宿主细胞组分在理化特性上的差异将病毒粒子区分出来，并尽可能保持侵染力。 目的是确切地研究病毒理化、生物学特性、化学组分、组成、增殖过程及机制，还可用于制备高效价的抗血清。 1953年，斯坦利第一次提取并结晶了 TMV，这是病毒学史上一个重要的里程碑。 （一）病毒的纯化与提纯 一般纯化方法 动物病毒的纯化：从空斑、病斑分离，用终点稀释法 植物病毒的纯化： 如确定是一种病毒，且可机械摩擦接种，则接种到适当寄主上； 如可能有多种病毒，则要嫁接传染，先将病毒保存，然后试用虫媒或其他方法分离。 二、病毒的分离与培养 1、差速离心和密度梯度离心 差速离心：交替使用高速和低速离心 高速离心（40000~80000g）使病毒沉淀，取沉淀 低速离心（约4000g）仅去除大的细胞碎片等杂质，取上清 密度梯度离心：部分或完全根据颗粒在一个无对流介质中的密度而获得分离 蔗糖10%~40% CsCl等 （三）病毒提纯的技术 二、病毒的分离与培养 2、沉淀法 简便快速但粗糙易变性 盐析法 硫酸铵浓度达30~50%饱和度时多数病毒沉淀 等电点沉淀 加醋酸或盐酸 丙酮沉淀 浓度达40~70% 聚乙二醇沉淀 浓度达4~8% 乙醇沉淀 浓度达20% 沉淀植物蛋白，上清夜用硫酸 铵沉淀 3、吸附法