木糖代谢关键酶因克隆及重组酵母菌株构建.pdfVIP

摘要 生物乙醇作为一种清洁、便捷的可再生能源，被纳入许多国家的发展战略规划。廉价 的原料和高效转化工艺是燃料乙醇商业化生产的必要条件，利用可再生植物纤维资源生物 转化制取乙醇的研究成为当前的热点，其中木糖的高效乙醇发酵是该技术工业化的基础和 制约因素。迄今发现或构建的微生物和工程菌株的木糖发酵生产性能仍然不能达到工业生 产的要求，严重制约了植物纤维原料生物转化制取乙醇的产业化，寻求性能优良的木糖发 酵菌株和研究微生物木糖代谢工程成为该领域的重点。 本文利用分子标记技术对能够发酵木糖或植物纤维原料水解液的酵母菌种质资源进 行了鉴定和亲缘关系研究，并通过转基因技术将不同酵母的优良遗传性能进行基因重组， 构建出不同类型的表达质粒及木糖发酵重组酵母菌株，在此基础上开展了酵母木糖代谢工 程的初步研究，主要研究结果如下： 除l株Saccharomycess 毕赤酵母属、酒香酵母属、裂殖酵母属和酿酒酵母属等共6个属20个酵母菌株形态学和 生理学特征与酵母菌检索表(Lodder，1970)一致，从而鉴定了上述酵母菌株的种质。 在所鉴定的酵母菌株中，部分酵母属间的形态学和生理学特征差异比较明显，但种间 的差异不明显，难以通过形态学和生理学进行酵母的种间分类鉴定。与传统的酵母菌分类 鉴定方法相比，随机扩增多态性DNA(random DNA，RAPD)分 polymophisic amplified 子标记技术更精确简便，可直接或间接检测和鉴定遗传相对稳定的基因组DNA，能够更 准确地反映酵母菌种间的亲缘关系，在酵母菌的分类鉴定上更具有优越性。 个引物扩增出15．1条谱带，其中多态位点高达90％以上。RAPD分子标记的聚类分析结 shehataeNL shehataeNL05与C 果表明，各酵母属间的RAPD结果差异显著，Candida shehataeNL02之间的遗传距离仅为0．010。4个酿酒酵 01为同～种酵母菌株，它们与c 母菌株的种间遗传距离低于0．100。2个Candidasp．Berkh的种内遗传距离为0．020。2个 sapitisNL03的种间遗 嗜单宁管囊酵母的种内遗传距离为O．070。PichiastipitisNL03和P 传距离为O．052。 休哈塔假丝酵母与热带假丝酵母之间遗传距离为0．114，它们聚类后与毕赤树干酵母 之间遗传距离为O．493；粟酒裂殖酵母与卡斯伯洒香酵母的遗传距离为0．322；嗜单宁管囊 酵母与克鲁斯假丝酵母间的遗传距离为0．383。它们与酿酒酵母问的遗传距离达到O．443， Candida Berkh与其它酵母菌之间的亲缘关系 与产朊丝酵母聚类的遗传距离是O．471； sp 较远，遗传距离达到0．567。 该研究成果充实了酵母菌分类鉴定的数据资料，尤其是为植物纤维原料生物转化制取 乙醇的微生物种质资源研究提供了理论依据。 通过PCR扩增成功获得毕赤树干酵母的木糖还原酶基因XYLl和木糖醇脱氢酶基因 bp，与GeneBank公布的相关序列 XYL2片段，它们的序列长度分别为1977bp和1910 证i 3260和gi 的序列中均不含内含子，含有酿酒酵母基因转录所必需的启动子和终止子区域。XYLl转 译可得到分子量为36102 为38380 Daltons的多肽链(含有363个氨基残基)。 kb口士、10 和YEp—X1X2，它们分别含有XYLl和XY