第八章基因重组蛋白包涵体的复性精品.pptVIP

色谱法复性 亲和色谱复性：可以在所要表达的蛋白的N端或C端加上一段重复的His或Arg片段（His-Tag or Arg-Tag），构建成融合蛋白，这样重组蛋白可以利用它们的Arg-Tag或 His-Tag结合到金属（Ni、Zn或Co）离子亲和色谱柱上，然后进行复性，最后用咪唑或pH梯度洗脱下来，如对大肠杆菌表达的重组Toc75和LHC2复性。 亲和层析 各种重组蛋白质复性方法的比较 复性方法 复性率 蛋白浓度 过程集成性 成本 传统方法(稀释、透析、超滤) 蛋白浓度低时高 蛋白浓度高时低 低 无 低 改进后传统方法（温度跳跃、分批进料、连续进料） 较高 较高 无 较低 新方法 抗体法 高 高 无 高 分子伴侣法 高 高 无 高 人造 分子伴侣法 高 高 无 较低 反向微团法 高 低 无 较低 双水相法 不明 不明 将包涵体的溶解与蛋白的复性过程集成 较低 色谱法 高 高 将蛋白的复性与纯化过程集成 较低 复习 重点 第一章 概论 分离技术的发展趋势 第二章 生物产品分离提取技术 细胞破碎,萃取方法,沉淀方法 重点章节 色谱技术 亲和分离技术 电泳分离技术 * 选择标志的编码序列，可供筛选已确定载体是否进入了细胞 可控转录启动子（如lac、Trp或tac） ，经诱导后从克隆化基因产生大量的mRNA 转录调控序列如一个合适的核糖体结合位点和起始密码子ATG 一个多限制酶位点接头，便于外源基因以正确方向插入载体中 含有待表达基因的载体构建好后→转化导入大肠杆菌某一合适的菌株中 * 白细胞介素11(IL-11)一种促血小板生长因子，可直接刺激造血干细胞和巨核祖细胞的增殖，诱导巨核细胞的成熟分化，增加体内血小板的生成，用于实体瘤、非髓性白血病化疗后Ⅲ、Ⅳ度血小板减少症的治疗 * 肝素首先从肝脏发现而得名，天然操作于肥大细胞，现在主要从牛肺或猪小肠黏膜提取。肝素是一种由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂。制剂分子量在1200～40000，抗血栓与抗凝血活性与分子量大小有关。肝素具有强酸性，并高度带负电荷目前最熱門的研究是將癌細胞周圍的血管以藥物阻斷, 使生長快..速的癌細胞無法獲得營養與氧氣, 將癌細胞餓死, 這方面的藥物有許多種, Angiostatin是人體中就有的, 由Harvard的Dr. Folkman發現, 同群研究小組還發現另外一種稱為Endostatin的抗癌物, 兩者都是新生血管的抑制物, 所以也是利用餓死癌細胞的方法來抗癌, 而且非常安全無副作用, 因為它們幾乎除了癌細胞以外, 不會對正常細胞發生攻擊, 可以說是新一代癌症導彈, 目前這兩種新藥已經進行動物實驗, 成效良好,但是距離完成人體試驗上市可能還要等上幾年, 但是這結果絕對是值得等待的 第八章 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 北京化工大学 谭天伟教授 重组蛋白的复性概述 包涵体的形成 包涵体的分离纯化 蛋白质复性方法 基因重组蛋白包涵体的分离和复性 包涵体的分离和蛋白质复性 随着基因工程技术的迅猛发展，人们可以在外来宿主细胞中控制目的蛋白质的生产，从而为临床和工业生产提供一些因自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质多肽产品。 迄今为止，人们已经成功地实现了用多种原核、真核表达系统生产基因工程蛋白 基因工程表达产物后处理的特殊性 8.1 重组蛋白质 大肠杆菌的重组菌 有多种可选择的质粒； 重组遗传背景清楚，基因表达易于控制； 蛋白表达量高（可达总蛋白50％）； 酵母 易于糖基化和正确形成二硫键； 表达产物分泌至胞外，易分离纯化； 易于大规模培养和生产 动物细胞 产物分泌至培养液，易分离纯化； 重组蛋白活性和天然蛋白一样； 表达质粒易于得到； 重组细胞可以大规模培养 补充：蛋白质在E.coli中的表达 E.coli表达系统优点： 操作方便 遗传背景清楚 廉价培养基中迅速生长→发酵成本低、周期短 目的蛋白可获高水平表达 →E.coli是生产重组蛋白的首选表达系统，特别是对那些不需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物活性的基因工程蛋白 51％ 8.2 包涵体的形成 在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物 包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误