科学仪器学 基因测序仪.pdf

内容提要 一、工作原理 （一）双脱氧链末端终止法测序原理 （二）新生链的荧光标记原理 （三）荧光标记DNA的检测原理 二、全自动DNA测序仪的结构与功能 （一）仪器的组成 （二）仪器各组成部分的功能 三、全自动DNA测序仪的常见故障及维护 （一）毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 （二）平板电泳型DNA测序仪的常见故障及维护 四、全自动DNA测序仪的进展 五、全自动DNA测序仪的主要应用 小结 测序仪 DNA测序 核苷酸序列  早期：小片段重叠法 通过测定RNA序列来推测DNA序列 缺点：既费时又不准确  20世纪80年代以后 ：DNA 自动测序仪 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确 一、全自动DNA测序仪工作原理 Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法  都是根据在某一固定的点开始核苷酸链的延伸，随机在某一个特 定的碱基处终止，产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷 酸链，在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳进行片段的分离和检测，从 而获得DNA序列  双脱氧链末端终止法更简便和更适合于光学自动探测，故在全自 动DNA测序仪中应用广泛 （一）双脱氧链末端终止法测序原理  利用DNA的体外合成过程－－聚合酶链反应 （polymerase chain reaction, PCR ）  DNA聚合酶的催化  以目的DNA为模板  按照碱基互补配对原则 单核苷酸聚合形成新DNA链  在引物的引导下 （一）双脱氧链末端终止法测序原理  普通的PCR反应体系中，加入的核 苷酸单体为4种2’-脱氧核苷三磷酸 （dATP，dCTP，dGTP，dTTP ） dNTP结构示意图 （一）双脱氧链末端终止法测序原理  测序反应体系中，加入的核苷酸单体 为2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP） ddNTP结构示意图 （一）双脱氧链末端终止法测序原理 与dNTP相比，ddNTP在脱氧核糖的位置上缺少一个羟基， 反应过程中虽然可以在DNA聚合酶作用下，通过其磷酸基团与 正在延伸的DNA链的末端脱氧核糖-OH发生反应，形成磷酸二酯 键而掺入到DNA链中，但它们本身没有-OH，不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键，从而使正在延伸的DNA链在此终止。 （一）双脱氧链末端终止法测序原理 据此原理分别设计四个反应体系，每一反应体系中存在相同 的DNA模板、引物、四种dNTP和一种ddNTP(如ddATP)，则新合成的 DNA链在可能掺入正常dNTP的位置都有可能掺入ddNTP而导致新合 成链在不同的位置终止。由于存在ddNTP与dNTP的竞争，生成的反 应产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。 （一）双脱氧链末端终止法测序原理 Template dNTPs Polymerase Primer Terminator A G C T 双脱氧链末端终止法测序反应原理（1 ） （一）双脱氧链末端终止法测序原理