第二章DNA的复制分子生物学精品.pptVIP

一、DNA 复制假说 Meselson－Stahl实验 对15NDNA、14NDNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。 ＊ 1963年Cairns用放射自显影方法阐明了大肠杆菌DNA的复制是半保留复制且DNA是环状分子。 二、半保留复制 2、DNA半保留复制的类型 2） 环状DNA：θ型（双向、单向）、 D型、滚环 3、参与DNA复制的物质 4）DNA聚合酶（DNA Polymerase）： 以dNTP为前体催化合成DNA 需要模板和引物的存在 不能起始合成新的DNA链 催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-OH末端 催化DNA合成的方向是5→3 A 原核生物聚合酶 在复制叉处为一二聚体 核心酶（core enzyme）：α、ε、θ。 α：聚合作用； ε：3’－5’外切；θ：与亚基结合有关； γ、δ、δ’、χ、ψ提高反应速率和持续性； β：使DNApol能结合在DNA上。β亚基结合于DNA时消耗ATP；如同一个夹子，使DNApolⅢ结合于DNA。 τ：使两个DNApol单体形成二聚体，分别在复制叉的两个链上作用。 DNA Polymerase III Holoenzyme 5） 解链酶（unwinding enzyme/ helicase ） 6） 引物酶（Primase） 蛋白因子i、n、n”与蛋白dnaC跟引物预合成有关； 蛋白因子n’和蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。 7）单链结合蛋白 8） 拓扑异构酶(topoisomerase)： 可使DNA拓扑异构体互变的酶。 拓扑异构酶Ⅰ：MW＝100kD，单肽链，含3－4个Zn 作用： 每次改变一个连环数； 结合DNA，使该处溶解； 形成酶－DNA复合物； 切割双链中的一股，使DNA中的一股链穿越切割点； 断裂单链连接 作用： 使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。 Ⅰ型：MW＝95kD，单体蛋白，不需ATP； Ⅱ型：MW＝150－180kD，均为二聚体，需ATP和 Mg2+。 9） 连接酶 ? T4Ligase特性： 可连接DNA与DNA，也可连接RNA与RNA； 可连接DNA中的单链切口，也可连接粘性末端切口和平砌末端切口； T4Ligase可作为重组工具酶。 半不连续复制： 在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3’ 5’方向的母链作为模板指导新的链以5’ 3’ 方向连续合成， 另一股以5’ 3’ 为方向的母链则指导新合成的链以 5’ 3’方向合成1000—2000个核苷酸长度的许多不连续的片段（岗崎片段），这种复制方式称之为半不连续复制。 ? 前导链（leading strand）： DNA复制时，一股以3’ 5’方向的母链作为模板，指导新合成的链以5’ 3’方向连续合成的链称为前导链。 （复制方向与解链方向一致） ? 随从链（lagging strand): DNA复制时，一股以5’ 3’方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5’ 3’合成，1000—2000个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。 （复制方向与解链方向相反) ? 冈崎片段（Okazaki）： DNA复制时，一股以5’ 3’方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5’ 3’合成1000—2000个核苷酸不连续的小片段称之为冈崎片段。 冈崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。 5、复制的过程 复制起点在复制过程中呈现叉子的形式，被称为复制叉（Replication fork） DNA复制从起点开始进行直到终点为止，每一个这样的DNA单位称为复制子或复制单元(replicon) 一个复制子只含有一个复制起点。 原核生物中只有一个复制起点，一个复制子 真核生物中可以从许多起始点同时进行，即有多个复制子 B 复制方向 a. 大约20个左右的DnaA蛋白首先与OriC中的4个9碱基重 复区相结合；HU蛋白参与并促进这一过程；b. 识别并使3个13碱基串联重复区DNA形成开环结构；c. SSB和旋转酶（拓扑异构酶）参入； d. DnaB蛋白在DnaC的帮助下与未解链序列结合。每六个 DnaB蛋白形成一组并与一条DNA母链结合，可在不方 向同时起始DNA的复制。