自拟逆纤方治疗实验性肝纤维化的作用及机制的研究.pdf

中文摘要 一研究目的 肝纤维化为诸多慢性肝病发展至肝硬化过程中所共有的病理组织学变化，是影响 慢性肝病预后的重要环节，在尚无有效方法根治原发疾病的情况下，减缓或阻止肝纤 维化进程是相当重要的治疗对策。在我国，病毒性肝炎、血吸虫病和酒精性肝病是引 起慢性肝病的三大主要病因。根据1992年全国病毒性肝炎血清流行病学调查，我国 的1／3。其中慢性肝炎患者约有3千万人，这些患者均有可能或已经发展为肝纤维化。 因此肝纤维化的群体是十分巨大的，所以寻找治疗肝纤维化的有效方法就显得十分迫 切而必要。 在治疗方面，目前西医治疗肝纤维化尚无具有特异性疗效的方法，而中医药却在 治疗肝纤维化上表现出独特的优势，逆纤方由白花蛇舌草、丹参、山药、旱莲草、太 子参、白芍等11味中药组成，具有清热解毒、扶正活血化淤的作用。在以往的实验 研究中证实其具有确切的抗HBV、保护肝损伤的作用。本实验采用二甲基亚硝胺 (DMN)建立肝纤维化动物模型，研究中药复方逆纤方治疗大鼠实验性肝纤维化的分 子机制，为中医药治疗肝纤维化提供理论依据。 二研究方法 实验主要包括三个部分： 1、逆纤方抗肝纤维化的体内外实验研究 腹腔注射，剂量为lo*,LDMN／Kg体重，空白对照组同时腹腔注射生理盐水，共注射 4周，每周第1天记录大鼠体重变化。第4周注射结束后随机分为模型对照组、鳖甲 软肝片组、逆纤方水提大剂量组、逆纤方水提小剂量组、逆纤方醇提大剂量组、逆纤 方醇提小剂量组，除模型组14只外，其余各组均为12只。鳖甲软肝片组以29／Kg体 重灌胃，逆纤方水提大、小剂量组分别以309／Kg、15g／Kg体重灌胃，醇提大、小剂 量组亦分别以309／Kg、15∥Kg体重灌胃，模型及空白对照组均用生理盐水灌胃 10ml／Kg。所有大鼠均每天称体重并灌胃，共灌胃21天。从造模开始到实验结束详细 记录大鼠的死亡情况。实验结束时用速眠新腹腔注射麻醉大鼠后摘眼球取血收集血 清，肉眼观察腹水多少、清晰度、性质及肝脏形态、颜色，并取左前叶肝脏，部分置 于Bouin液固定，进行HE染色、Masson染色及a．SMA、I型胶原免疫组化。 用HSC-T6细胞作为体外模型，将逆纤方药物原液倍比稀释成10个浓度进行上 药，丹参注射液作为阳性对照药物倍比稀释7个浓度上药，用MTT法检测药物细胞 毒性，计算细胞TC50，评价逆纤方对HSC增殖的抑制作用。 Fas／FasLmRNA表达的影响 2、逆纤方对肝纤维化大鼠及体外培养的HSC 本实验部分拟在实验一的基础上，从HSC细胞凋亡着手，进一步探讨逆纤方抗肝 纤维化的机制。采用Anncxin、佃I双染结合流式细胞仪检测HSC凋亡情况。同时运 mRNA的表达进行相对定量。 3、逆纤方对HSC-T6细胞uPA、PAI-1、TIMP．1及MMP-13mRNA表达的影响 实验三从uPA纤溶系统出发，用免疫组化法检测肝纤维化大鼠肝组织中uPA和 PAl．1蛋白的表达并观察逆纤方的调控作用；同时运用实时荧光定量PCR方法，对体 外培养的HSC-T6细胞uPA、PAI-1、lIMP．1及MMP-13mRNA表达进行相对定量， 初步探讨uPA纤溶途径与肝纤维化的关系及逆纤方的调节作用。 三实验结果 ： 1、逆纤方抗肝纤维化的体内外实验研究 对DMN诱导的大鼠肝纤维化模型，逆纤方水提大、小剂量组均可降低大鼠血清 项血清学指标，但效果不及逆纤方水提大、小剂量组。 病理结果HE染色显示，正常对照组大鼠肝脏结构完整，模型对照组可见肝小升 失去正常结构，胶原纤维沿界板破坏处向肝小叶内延伸，多数形成假小叶，所有切片 均可见程度不等、范围不一的肝组织坏死区、多发出血灶，中央或局部有炎性细胞浸 润；逆纤方水提大剂量组肝小叶结构破坏不明显，有2个标本大量纤维沉积于汇管区， 其中1个形成假小叶，其余可见纤维条索，大部分肝细胞排列整齐，所有标本均有少 量炎细胞浸润；逆纤方水提小剂量组标本也可见汇管区纤维沉积，有炎细胞浸润，肝 细胞排列紊乱；逆纤方醇提大剂量组所有标本可见汇管区大量纤维沉积，肝细胞排列 不整齐，炎细胞浸润，3个标本有出血灶；逆纤方醇提小剂量组也可见汇管区纤维沉 积，有炎细胞浸润，肝细胞排列紊乱。 体外实验显示，在药物作用24h后，逆纤方对HSC．T6的半数毒性浓度TC卯为 物作用24h后，逆纤方及丹