封闭连续细胞培生产流感病毒工艺过程关键技术的研究.pdf

封闭连续细胞培养生产流感病毒工艺过程关键技术的研究 摘要 流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，在季节 性流行时，能在全世界迅速传播，造成大量的经济损失和社会危害， 全世界每年约有lO亿人口感染流感病毒，其中重症病N300500万， 死亡人数2550万，免疫接种流感疫苗仍是最为有效和经济的方式。 与传统鸡胚生产方法相比，动物细胞培养生产流感方法具有很多 优势，如抗原匹配性好，能够实现大规模生产和自动化控制，可以在 短时间内大量生产流感疫苗，减少过敏反应等。世界卫生组织鼓励各 国发展细胞培养技术生产流感疫苗。 针对目前细胞培养生产流感病毒的现状，本文首次提出了一个包 括细胞培养、病毒生产和病毒灭活在内的封闭、连续、在位灭活的细 胞培养生产灭活病毒疫苗新工艺。通过连续操作，能够在较少空间内 快速大量生产病毒。通过将细胞培养和病毒生产过程分开，可以把病 毒生产过程安置在一个较小的高安全等级空间内进行，大大提高了操 作安全性和降低了病毒泄漏危险性，尤其适合那些高致病性、高危险 性病毒疫苗的制备过程。 通过使用Vero细胞增殖禽流感病毒H9N2，本文针对封闭连续工 艺过程的一些关键技术开展研究，包括细胞对流感病毒敏感性分析、 细胞微载体培养生产病毒工艺、细胞珠到珠转移、转移后细胞对病毒 增殖敏感性验证、细胞无血清培养生产流感病毒、代谢分析、可模拟 连续操作的多次间歇式珠到珠转移培养细胞生产流感病毒等方面。 病毒经过在Vero细胞上连续传代，会逐渐适应，可以产生高血凝滴 滴度可达2．2~2．3 unit／1 lognA001aL。 为了规模化培养，研究了细胞微载体培养生产流感病毒的可行 性，发现细胞最适培养条件是：接种密度为2．0x 含量为29／L、转速35rpm。3天左右，微载体上基本长满细胞，细胞 H9N2，当感染复数为O．1时，病毒感染48h后，空斑形成单位达到 最大值，约为5．8 lo妒FU／mL，此时收集病毒，可以适合减毒活疫苗 的制备；病毒感染60～72h后，病毒HA滴度达到最大值，约为 3微载体间通过珠到珠转移的可 接下来考察Vero细胞在Cytodex 行性，发现Vero细胞主要依靠载体间形成的细胞桥实现珠到珠转移， 5“g／mL胰酶并不能促进细胞在载体间转移。本文应用田口方法首次 分析了影响建桥率的因素。搅拌时间、静止时间两个因素和搅拌时间 ／静止时间、搅拌速度／静止时间两个相互作用对新老微载体之间细胞 桥的形成过程有显著影响。在新老载体比例为2：1的放大中，间歇搅 拌8h，新载体建桥率在21％左右，然后以35 rpm连续搅拌，新老载体 Ⅱ Vero细胞珠到珠转移后，接种流感病毒，血凝滴度逐渐增加，4天后 稳定在2．1~2．2109HA 生产流感病毒，这为流感病毒扩大生产提供了一条简单路线。 本文又首次考察了EX．CELLTMVero无血清培养基培养Vero细胞 1对Vero细胞的接 生产流感病毒的情况。发现Cytodex3比Cytodex 种效率更高，采用每隔30 式，在200 CaCl2促进下，经过8h间歇搅拌，细胞接种效率在 mg／L 53％左右。无血清培养可以培养Vero细胞生产流感病毒，其中细胞 生长速度比用含血清培养基培养时慢，需要4天到达稳定生长期，但 病毒增殖情况在两者中没有明显差异。同时发现无血清培养细胞后无 需换液，直接接种病毒，仍能够获得满意的病毒增殖效果，病毒滴度 由于受实验条件的限制，本实验采用多次间歇加料的方式来模拟 连续培养过程，经过4次新老载体1：4比例的放大培养，发现细胞 密度可以保持稳定，而病毒产量有轻微下降的趋势，这可能是由于病 毒生长环境比较恶劣的缘故。 最后，本文还对悬浮细胞生产流感病毒的封闭连续系统进行了展 望，对有关动力学参数的测定建立了相关数学公式模型，希望能够对 其它细胞系和高致病性、高危险性病毒的封闭连续大规模生产提供参 考和借鉴。 关键词：流感病毒，细胞培养，微载体，代