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黑暗链霉菌中安普霉素3’-脱氧酶基因的研究 倪现朴，侯曦凡，夏焕章* 沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳（110016） E-mail ：xiahz612@ 摘要：黑暗链霉菌主要产生安普霉素、氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素 B。为确定安 普霉素 3’-脱氧酶基因，对安普霉素生物合成基因簇中 aprD3基因进行了阻断，阻断变株发 酵产物与出发菌株相比多出一新组分，通过质谱、核磁对新产物结构进行解析，该新组分为 3’-羟基安普霉素，证明 AprD3催化安普霉素生物合成过程中 3’-脱氧反应。 关键词：黑暗链霉菌；aprD3基因阻断；3’-脱氧酶；3’-羟基安普霉素 中图分类号：Q933 ，R978 1．引言 氨基糖苷类抗生素中 3’-羟基是磷酸转移酶APH 3’ 作用的靶点，3’-磷酸化后造成抗生素 失活[1] 。对 3’-脱氧基因的研究可以为全面阐明氨基糖苷类抗生素的生物合成机制，同时也 为利用基因工程技术获得 3’-脱氧氨基糖苷类抗生素奠定基础。 本实验以产生妥布霉素和安普霉素的黑暗链霉菌为研究对象，寻找并确证安普霉素生物 合成基因簇中与 3’-脱氧有关的基因。安普霉素生物合成基因簇已被克隆，在已测序的安普 霉素生物合成基因簇中，通过同源分析发现有 aprD1 、aprD2 、aprD3 、aprD4 和 aprD5 可能 是脱氧酶基因。本文对其中的 aprD3 基因的功能进行了详细研究，首次报道了 aprD3 基因 为安普霉素 3’-脱氧酶基因。 2 ．材料和方法 2.1 材料 2.1.1 菌株 E.coli DH5α：克隆用的宿主菌 E.coli ET12567 pUZ8002 ：接合转移质粒用的宿主菌 黑暗链霉菌 H6 ：安普霉素和氨甲酰妥布霉素产生菌 2.1.2 质粒 pIJ2925 ：大肠杆菌克隆载体 pHZ132 ：大肠杆菌-链霉菌温敏型穿梭质粒，用于接合转移 pSPU111 ：提供红霉素抗性基因，作为筛选标记 pNXP5 ：aprD3 阻断用质粒 本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金课题资助（安普霉素生物合成关键基因的研究，座机电话号码005） - 1 - 2.1.3 培养基 LB 培养基：用于大肠杆菌培养 2×YT 培养基：用于大肠杆菌培养 CP 培养基：用于黑暗链霉菌的菌丝培养 MS培养基：用于链霉菌和大肠杆菌间质粒的接合转移[2] SM培养基：用于链霉菌的孢子培养[3] 2.1.4 引物 表 1 引物序列 Name sequence primer 1 CGGAAGCTTGTGCGGATGTACTCGATGC primer 2 CCCTCTAGATCCTGCTCACCAACACCTACGG primer 3 TATGGATCCCTCGGCCGGCCAGCTCC primer 4 ATAGGTACCACATCAGTTCCCTGCCGTCGC 3．方法 3.1 aprD3 阻断变株△aprD3 的获得 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化及常规DNA 克隆操作参考文献[4]，链霉菌的总DNA 的提取参照文献[2] 。 所用引物列于表 1。以黑暗链霉菌H6 总 DNA 为模板，PCR 扩增 12 和 34 片段，将 12、 34 和红霉素抗性基因与 pHZ132 连接，得 aprD3 基因阻断用质粒 pNXP5 。 pNXP5 先转化入大肠杆菌ET12567 pUZ8002 中，通过接合转移的方式转化入黑暗链霉 菌H6 [5] 。利用红霉素抗性作为筛选标记，得到转化子后，转化子先在无药合Ⅴ平板上传三 代，再挑单菌落同时点种于无药和有药合Ⅴ平板（红霉素 100μg/ml ），挑选在无药平板能 生长而在有药平板上不能生长的菌，提总DNA ，PCR验证是否为双交换菌株。 3.2 阻断变株的发酵及产物的分离纯化 发酵条件同出发菌株，发酵结束后，按发酵液体积的 0.5%加入草酸，H SO 调至pH2.0 ， 2 4 静置数小时。离心，上清液用浓氨水调至pH8.0 。静置过夜，离心。上清浓缩至4000～5000u/ml， 用H SO 调至pH5.5 。732 树脂静态吸附 4h 。用0.6mol/L NH Cl +3%氨水洗脱，收集活性部 2 4 4 分。洗脱液浓缩至 8000～10000u/ml，H SO 调至pH6.5～7.0 。浓缩液上D151 柱，动态吸附。 2 4 0.05mol/L氨水洗脱，收集活性部分，浓缩至 8000～10000u/ml。调至pH6.5 ～7.0 ，上D152 柱，动态吸附。0.05mol/L氨水洗脱，收集活性部分,通过高效液相分析，纯度较高的合并， 冻干。 3.3 产物的结构分析 将发酵液过