sds—聚丙烯酰胺凝胶电泳（page）测定蛋白质分子量.ppt

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS一. 实验目的 1、学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 2、掌握垂直板电泳的操作方法。 二 .实验原理 在蛋白质溶液中，加入十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇后，巯基乙醇将蛋白质分子中的二硫键还原；而SDS将蛋白质的氢键、疏水键打开，并与蛋白质分子结合，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电荷，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其带电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 二 .实验原理 SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。SDS-蛋白质复合物在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS-复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，而长轴则与蛋白质的分子量（Mr）成正比。 因此，SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而仅于蛋白质的分子量相关。 三. 实验材料、试剂和主要器材 2. 试剂 5、1×电极缓冲液： Tris-甘氨酸缓冲液，1000mL　　　　5×电极缓冲液: 200mL　　双蒸水定容至1000mL6、10%过硫酸铵（10%AP）溶液：10mLAP: 1g　　　双蒸水定容至10mL，分装后-20℃保存　7、2×样品处理液：20mL　　4×浓缩胶缓冲液: 5mL　　　溴酚蓝: 0.02g　　SDS: 0.8g　　　甘油: 4mL　　β-巯基乙醇: 0.4mL　　　双蒸水: 10.6mL　8、染色液：1000mL　　甲醇: 454mL　冰乙酸: 92mL　考马斯亮兰R-250: 0.5g　　双蒸水定容至1000mL9、脱色液：1000mL　　甲醇: 50mL　　冰乙酸: 70mL　　双蒸水定容至1000mL10. TEMED：商品化试剂，直接使用 3. 实验器材 垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液枪 滤纸 染色缸 水浴锅 四、操作步骤 四、操作注意事项： 五.分析计算 绘制标准曲线：      以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可测出其分于量，这样的标难曲线只对同一块凝胶上的样品的分子量测定才具有可靠性。 六.作业 在不连续体系SDS中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 在不连续体系SDS中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 样品溶解液中加入巯基乙醇的作用是什么？ 垂直板电泳装置 北京市六一仪器厂　DYCZ-24DN 　6个 胶室的体积：10ml*6=60ml 因此：分离胶：6ml*6=36ml 浓缩胶：4ml*6=24ml 缓冲液：400ml＊6＝2400ml * * 1)低分子量标准蛋白： 10ml 卵蛋白片 　　MW=42,700 牛白蛋白 　 MW=66,200  　α－糜蛋白酶 MW=25,000　　　　　　　　　　核糖核酸酶 MW=13,700  细胞色素C 　 MW=11,700　　　　　　　　　　胰蛋白酶 　　　　　　　　　　蔗糖酶　　　用样品溶解液溶解，使其为2mg/ml的标准蛋白溶液。 2)从牛奶中提取的酪蛋白 1.材料 1、30%Acr-0.8%Bis：100mL 　　Acrylamide（Acr）: 30g 　　N,N’-Methylenebisacrylamide（Bis）: 0.8g 　　双蒸水定容至100mL，0.45μm过滤，4℃保存 　Acr和Bis依据不同的产商质量差异较大，溶解后过滤除去颗粒物 2、4×分离胶缓冲液：1.5M pH8.8 Tris-HCl-0.4%SDS，50mL 　　Tris base: 9.075g　　　　浓HCl: 约1.5mL 　　SDS: 0.2g　　　　　　双蒸水定容至5