氨氧化细菌的分生物学检测方法及应用.pdfVIP

氨氧化细菌的分子生物学检测方法及应用研究 摘要 自然状况下的化能无机自养氨氧化细菌具有生长速率低、生物量小和对环境 因子敏感等生理特点，因此传统的MPN-Griess计数法限制了对海洋氨氧化细菌 的进一步研究。本研究同时采用传统的MPN．Griess计数法与新兴的分子生物学 定量检测方法FISH法与MPN．PCR法对胶州湾表层沉积物中氨氧化细菌数量进 行检测，旨在建立快速、准确的海洋氨氧化细菌数量研究的生物学测定方法。此 外，本实验采用已优化的FISH法与PCR．DGGE技术对长江口临近海域表层沉 积物中氨氧化细菌生态特征进行了研究。 为保证检测结果的准确性，本文首先通过正交实验筛选FISH法最佳实验条 件与PCR扩增最佳的反应体系。研究显示荧光原位杂交(FISH)技术在检测海 洋环境中氨氧化细菌的最佳实验条件为：热固定2h，乙醇脱水3min，杂交温度 系确定为：模板DNA29l，amoA基因引物0．99mol／L，dNTPs 0．15mmol／L，MgCl2 1．5mmol／L，Tag酶1．5U，复兴温度55℃。 MPN—PCR法，更适宜近岸氨氧化细菌数量分布特征及环境作用研究，但由于FISH 法在贫营养区不能准确检出氨氧化细菌数量，因此可以在这类海区采用以FISH 法为主、MPN-PCR法为辅的氨氧化细菌定量测定方法，以保证氨氧化细菌数量 检测结果的可靠性和完整性。 结合的方法对长江口临近海域表层沉积物中氨氧化细菌生态特征进行了研究。研 究显示氨氧化细菌数量分布具有河口高，离岸低，沿长江入海口向外逐渐减少的 趋势。此外，长江口临近海域的氨氮浓度对氨氧化细菌有明显影响；该海区的氨 氧化细菌生物多样性指数平均为0．78，该指数与温度、盐度、NH4+-N、N03’．N 以及硝化速率等均存在显著的相关性；结合长江口临近海域氨氧化细菌的同源性 与其它区域存在较大差异，表明不同种群的氨氧化细菌在氮循环中发挥的作用不 相同。 MPN．PCR 关键词：氨氧化细菌FISH PCR-DGGE长江口生物多样性 ofTheMolecular for Methods ApplicationStudy Biological Bacteria Ammonia-Oxidizing ABSTRACT bacteriahave unfavorable Chemolithoautotrophicammonia-oxiding many biomassand to physiologicalcharacteristics，namely,slowgrowth，small susceptible environmentalfactors．Traditionalmethod restriet ofMPN．Griessthe ofmarine study bacteria．Inorderto and methodfor ammonia-oxiding gainfleetly effectively bacteria inmarine detectingammonia-oxidizing