次郎柿与上西早柿acc氧化酶的转基因研究.pdf

摘要 本研究以次郎柿与上西早生柿两种甜柿组培苗叶片为外植体，通过对抗生素筛选 条件和根癌农杆菌介导次郎柿与上西早生柿遗传转化条件的优化，建立了次郎柿与上 西早生柿遗传转化体系，将ACC氧化酶的RNAi基因导入次郎柿与上西早生柿组培 苗中，以期通过转基因的方法抑制ACC氧化酶的表达，提高跃变型果实的耐贮性能。 主要取得以下研究结果： 1 次郎柿转基因体系的建立 1．1研究了抗生素对叶片再生的影响，确定了适宜的抗生素浓度。 通过次郎柿叶片及组培苗对抗生素的敏感性试验，结果表明：在抗性苗生长过程 中，用200mg／L头孢霉素和30mg／L壮观霉素做为筛选转化抗性苗的筛选浓度。 1．2次郎柿转基因工艺路线 采用继代四年半的组培苗，取其顶端2~3片刚展开的嫩叶，从叶基部剪取4mm ×4 1．0 0．5 mm大小的叶片，叶背朝上，接种在DKW(1／2N)+ZTmg／L+TDZmg／L 的培养基上：暗预培养4 min，侵染 d后，用OD600值为0．5的菌液浓度侵染叶片10 1．0 时加入50mg／L的乙酰丁香酮。将侵染后的叶片外植体，再转到DKW(1／2N)+ZT 0．5 1．0 d，之后移入DKW(1／2N)+ZTmg／L+ mg／L十TDZmg／L的培养基上共培养3 TDZ0．5 mg／L+Cef200mg／L的培养基上黑暗脱菌培养3d：最后转入DKW(1／2N)+ ZT1．0 0．5 30 mg／L+TDZmg／L+Cef200mg／L+Spmg／L的培养基上光照选择培养， 1．0 30 每25d继代一次。继代7-8次后转入DKW+ZTmg／L+Spmg／L+Cef200mg／L 测得到27株转基因植株。 2上西早生柿转基因体系的建立 2．1研究了抗生素对叶片再生的影响，确定了适宜的抗生素浓度。 通过上西早生柿叶片及组培苗对抗生素的敏感性试验，结果表明：在抗性苗生长 过程中，用200mg／L头孢霉素和30mg／L壮观霉素做为筛选转化抗性苗的筛选浓度。 2．2上西早生柿转基因工艺路线 采用继代四年半的组培苗，取其顶端2~3片刚展开的嫩叶，从叶基部剪取4mm ×4 1．0 O．5 mm大小的叶片，叶背朝上，接种在DKW(1／2N)+ZTmg／L+TDZmg／L min，侵染 的培养基上；暗预培养3d后，用OD600值为O．3的菌液浓度侵染叶片10 1。0 时加入100mg／L的乙酰丁香酮。将侵染后的叶片外植体，再转到DKW(1／2N)+ZT 0．5 1．0mg／L+ mg／L的培养基上共培养4d，之后移入DKWU／2N)+ZT mg／L+TDZ TDZO．5mg／L+Cef200 1．0 0．5 30 ZT mgm的培养基上光照选择培养， mg／L+TDZmg／L+Cef200mg／L+Sp