海参脑苷脂的分纯化、结构分析及其生物活性研究.pdf

海参脑苷脂的分离纯化、结构分析及其生物活性研究 摘 要 海参是一种名贵的海洋滋补品，富含多种生物活性成分，具有较高的营养价 值和药用价值。海参脑苷脂及长链碱是存在于海参体壁中结构独特的鞘脂类化合 物，具有抗肿瘤、免疫调节、神经保护、抗菌等生理活性。海参脑苷脂包括三种 主要系列物，每种系列物中含有几十种单体化合物。本论文对仿刺参、海地瓜和 叶瓜参三种海参的脑苷脂及长链碱的分离纯化、分子组成和结构以及生理活性进 行了较为系统的研究，对于海洋新原料来源的发现、海参新型营养功效的补充、 海参的高值化开发利用具有重要意义。本文研究内容和结果如下： 1．建立海参中脑苷脂含量简便准确测定的新方法。采用高效液相色谱．蒸发 CN．80Ts柱为分离柱，正己烷．异丙醇 光散射检测法(HPLC．ELSD)，以TSKgel ．二氯甲烷．甲醇为流动相，在13min内实现了脑苷脂和神经酰胺的同时测定。其 法稳定性良好。在所测13种水产样品中，海星的脑苷脂和神经酰胺含量最高， 在所测8种海参中叶瓜参脑苷脂含量最高。结果表明该方法可行，样品前处理简 单，快速准确。结果提示包括海参在内的海洋食品可以作为功能性鞘脂类的良好 资源。 2．建立一套用于各种海参脑苷脂分离纯化的快速高效的完整新体系。首次 应用高速逆流色谱(HSCCC)技术成功优化了海参脑苷脂的分离过程。(1)海 ．参总脑苷脂：采用石油醚一甲醇．水(5：4：1，V／V)为溶剂体系的高速逆流色谱法， 从海参总脂中一步纯化制备出海参总脑苷脂，以总脂计得率约为7．6,-,12．4％，经 正相硅胶柱层析，收集氯仿：甲醇(80：20，VⅣ)洗脱组分，再采用乙酸乙酯一 乙醇．水(5：3．5：3．5，VⅣ)为溶剂体系的高速逆流色谱技术，将上述洗脱组分中严 重干扰海参脑苷脂纯化的硫酸酯化甾醇去除，制得海参脑苷脂系列物的总得率约 为1．1-6．4％，纯度均在90％以上。并以优化出的正相HPLC制备法进行了验证 比较。(3)海参脑苷脂单体化合物：采用反相HPLC法，C18半制备柱，98％甲 醇水溶液洗脱，从海地瓜脑苷脂系列物中分离出4个脑苷脂单体化合物，纯度在 90％以上。结果表明，所建立的脑苷脂纯化体系具有得率高、速度快、成本低等 突出优点，从根本上解决了海参脑苷脂纯化的难题。 3．建立海参脑苷脂分子种组成和结构筛选的高通量分析方法。 先采用气相色谱质谱联用(GC．MS)法，分析比较了三种海参脑苷脂系列 物的脂肪酸、长链碱和糖基组成差异。用10％盐酸／甲醇水解，正己烷萃取脂肪 酸甲脂组分，甲醇保留长链碱和糖基组分。脂肪酸甲酯直接用mNOWaX柱分析， 长链碱和甲基糖经硅烷化衍生后用HP．5MS柱分析。测定结果：所有脑苷脂系列 物的糖基都为葡萄糖基；脑苷脂系列物I的脂肪酸以非羟基脂肪酸为主，系列物 II和III的脂肪酸以羟基脂肪酸为主；系列物I和II中，少见的d17：l长链碱比例 较高，系列物Ⅲ中以t17：0长链碱为主，三种海参相比，仿刺参与叶瓜参的长链 碱组成相似，主要为d18：2和d17：l，而海地瓜长链碱组成较简单，主要为d17：l 和t17：0。并推测出9种海参脑苷脂系列物的结构通式。 又采用高效液相色谱．电喷雾离子阱．飞行时间质谱联用(LC．ESI．IT-TOF) ODS．100Z 技术，筛选分析三种海参总脑苷脂的脑苷脂分子种组成。采用TSKgel 柱分离，95％甲醇／水溶液洗脱，正ESI电离模式，根据一级质谱中同时出现的 200～ 8】+峰确定母离子，通过自动MS／MS采集rrdz 【M+H】+、【M+Na]+和【M+H-1 300子离子数据，并分析它们的结构。分别从海地瓜、叶瓜参和仿刺参总脑苷脂 中高通量筛选出12、4l、26个脑苷脂化合物，其中包含疑似新化合物28个。 最后，应用高效液相色谱．电喷雾四极杆．飞行时间质谱联用(LC．ESI．Q．TOF) 技术，成功建立了高通量、准确筛选分析脑苷脂分子种组成及结构的新方法。采 用PlusC18柱，95％乙腈／水洗脱，负ESI电离模式，自