草鱼骨骼肌肌球白重链同工型基因的cdna克隆与表达.pdf

上海海洋人学硕十论文 草鱼骨骼肌肌球蛋白重链同工型基因 的cDNA克隆与表达 摘 要 在鱼类肌肉蛋白质中，肌球蛋白占肌原纤维蛋白质的50％以上。它是一种普 通的真核细胞运动性蛋白，能和肌动蛋白结合形成细胞运动如胞质分裂和肌肉收 缩等所需的物质。普通的肌球蛋白一般由两条重链亚基(MHC)和两对不对称的轻 链亚基构成，而MHC具有肌球蛋白分子运动马达和细丝形成的作用，可以分为两 个功能性结构域：氨基端具有马达功能的头部球状区域和羧基端具有丝状形成能 力的一个具有0【．双螺旋长杆状结构域。而ATPase酶解和肌动蛋白结合位点都位于 重链头部区域sub蛳ent．1(s1)部位的两个表面环附近。草鱼属于广温性的淡水 鱼类，它的肌肉功能伴随栖息水温的变化而变化，以至于能够周年生活在温差极 大的栖息环境中。淡水鱼所具有的这种独特的温度适应能力与其肌原纤维蛋白质 主要是肌球蛋白性质的季节变化是密切相关的，而肌球蛋白的热稳定性通常会影 响鱼类肌肉的加工适性。因此本实验选取草鱼作为研究对象，分离和克隆骨骼肌 MHC的三种同工型基因，同时通过半定量PCR法初步了解这三种同工型基因伴 随温度变化的表达模式，并利用同源建模法对草鱼MHC三维立体结构进行了预 测。 1．本研究以自然条件下四个季节的草鱼为材料，提取骨骼肌总IⅢA，通过运 用逆转录PCR并结合RACE法等，成功地获得草鱼三种MHC同工型基因的全长 序列。经核苷酸序列分析，10．t)rpecDNA的全长序列为5968bp，编码区域核苷酸 长度为5790bp；I．typecDNA的全长序列为5957bp，编码区域核苷酸长度为 5799bp；30．type blast分析后发现与鲤科鱼类肌球蛋白序列具有很高的同源性，因此认为本实验获 得了草鱼骨骼肌肌球蛋白重链三种同工型基因的全长序列。 2．这三种同工型基因分别编码了1930、1933、1934个氨基酸序列。与鲤鱼， 兔子等其他哺乳动物的氨基酸序列进行比对分析，lO．type和I．t)，pe相似性为 另外这三种同工型氨基酸序列跟兔子的MHc全长cDNA比较，相似性分别是 80．3％，82．5％，81．9％。10．type氨基酸序列之所以呈现出与其他同工型这些差异， 主要是因为全长氨基酸序列共有145个变异位点，约占7．51％，其中S1就占到了 I 上海海洋大学硕士论文 97个。同时实验还对MHC中的两个重要区域S1和LMM进行初级结构的分析， 结果表明：S1区域中的两个表面环Loopl和Loop2氨基酸序列的差异引起草鱼肌 球蛋白ATPase的热稳定性变化；而LMM区域的28．残基重复排列模式分析图差 LMM能够形成更为稳定的0【一双螺旋结构。与其他哺乳动物做 异也证明了30．t)，pe 了个系统发育树分析，结果表明了草鱼和鲤鱼MHc的多基因家族与哺乳动物的骨 骼肌MHC更具有亲缘关系。 3．同样以自然条件下四个季节的草鱼为材料，提取骨骼肌总IⅢA，采用了半 变化时发现，冬季草鱼大部分表达的是10．t)，pe基因，而春季和夏季草鱼中主要表 达了I．帅e和30．type基因，而秋季则都有表达，但量很少。 4．运用生物信息学工具对草鱼MHC的三级结构进行了预测，获得了直观可 视的蛋白质立体图形，对肌球蛋白的研究做了非常有意义的尝试。从预测图形来 看，低温型的两个表面环的结构明显不同于另两种同工型，而LMM则完全显示典 型的0【．双螺旋结构特征。 关键词肌球蛋白重链，草鱼，同工型基因，旺一双螺旋，半定量lmPCR，三 级结构，系统发育分析，三维立体结构 II 上海海洋大学硕十论文 cDNA and of f．astskeletal cloningexpressiongrasscarp ● ■ ■ ● ● 一 CnalniStor