根癌农杆菌介导菜心(brassica campestris l. subsp. chinensis makino var. parachinensis tsenet lee)遗传转化与优化研究.pdfVIP

捅姜 本文以“油青四九”菜心种子为原材料，从获得无菌菜心苗到“油青四九”菜心转化体系的 建立，系统地研究了以子叶柄一子叶为外植体的“油青四九”菜心的高频再生体系和根癌农杆 菌介导的菜心遗传转化体系及其优化，较成功地获得了转入局铲基因的“油青四九”菜心植 株，并通过了PCR初步鉴定。 试验通过对影响“油青四九”菜心子叶柄一子叶外植体分化不定芽的AgNO，浓度、植物激 素及其配比、外植体苗龄等因素的研究，建立了子叶柄一子叶外植体的高效再生体系：在超 次，无菌滤纸吸干种子表面残留的水分后，均匀接种于盛有1／2MS培养基的无菌培养瓶中， 光照／8h黑暗的光周期的培养条件下培养出无菌苗；取3～7d苗龄的无菌苗近生长点处切下子 叶柄．子叶外植体接种于l／2倍Nil。+浓度的MS培养基的盐类及维生素 光照培养。20d左右外植体开始分化出芽，不定芽分化率为：48．57％。 利用植物遗传转化方法中的根癌农杆菌介导法对“油青四九”菜心子叶柄一子叶外植体的 遗传转化与优化加以研究。通过对影响菜心转化率的筛选剂卡那霉素、抑菌剂氨苄青霉素、 预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、外植体浸染时间、共培养时间、共培养温度、乙酰丁香 酮等因素的研究，建立了一套适用于菜心的可操作的遗传转化体系：取适量保存在．80℃冰 种抗生素 箱中的根癌农杆菌pBJ40／LBA菌液于含有50mg／LStr、50mg／LKan、50mg／LRif 的LB固体培养基中划线，在恒温培养箱内，28℃过夜培养；挑单菌落根癌农杆菌菌株于含 液体MS培养基重悬菌体后所得悬浮液作为浸染菌液；取5d苗龄的无菌菜心苗子叶柄一子叶 外植体，预培养2d；将外植体轻轻放入浸染菌液中浸泡10min，除去外植体上的菌液，共培 养2d；将外植体转移到含有5mg／LKan和300mg／LAmp的分化培养基上筛选，20d左右获 得抗性再生芽，转化率为2．98％。按照已建立的根癌农杆菌介导的菜心遗传转化体系，获得 16棵转化菜心植株，经PCR鉴定，阳性率为87．50％。 文中分别对影响“油青四九”菜心子叶柄．子叶外植体的不定芽分化率和转化率的几种因 素进行了讨论，为进一步提高“油青四九”菜心外植体的再生频率和对转／N．-EflF基因提供了 科学参考，为菜心遗传转化、获得新品种的菜心育种工作打下了理论基础。 关键词：菜心；高频再生体系；根癌农杆菌；日铲基因；遗传转化；优化 III and ofBrassica onGeneticTransformation Study Optimization Makino TsenetLee var．parachinensis L．Subsp．chinensis campestris mediated tumefaciens byAgrobacterium ProfessorKanYunchao Xiangyang；Vice Supervisor：Prof．Gao Yinjuan Master(Ph．D)Candidate：Wang of Brassica seeds campestris Abstract：Int