毒死蜱降解菌玫红红球菌(rhodococcus rhodochrous)hw-d3菌株遗传转化方法的研究.pdfVIP

摘要 有机磷农药毒死蜱是一种具有显著环境毒性的化学物质，目前在农业生产中用 量很大。玫瑰红红球菌(Rhodococcus 是毒死蜱污染生物修复的优良菌株，可用于基因工程菌构建的研究。本实验获得以 下主要研究结果。 1．采用抗生素梯度平板法，测定了HW．D3菌株对常用抗生素的抗性。Chl、 株在含30I-tg／mL Amp和Neo六种常用抗生素比较敏感。几种抗生素都可以作为HW．D3菌株遗传转 化的筛选压力。 12～24 h为对数生长期，之后进入稳定期和衰亡期。培养48h时HW．D3菌株对毒死蜱的 降解活性达到最高，而在细胞生长旺盛的对数期活性较低。 3．HW．D3菌株有一定的自养能力，高浓度的毒死蜱会抑制HW．D3菌株的生长。 实验中未发现水解圈等适合作为遗传转化筛选标记的菌落特征。 个分子量约15kb的质粒，拷贝数较少，不易于分子生物学操作，不适合用于构建 Matsui 遗传转化载体。为降低载体构建难度，减少后续实验工作量，本实验以Tom 1为材料构建载体，并研究 等构建的Rhodococcus．E．coli穿梭质粒表达载体pNC950 HW．D3菌株的遗传转化方法。 质粒DNA。 6．采用电转化和原生质体转化两种方法研究HW．D3菌株的遗传转化方法，但 均未得到质粒pNC9501的阳性转化子，可能由于HW．D3菌株的限制性内切酶系统 活性较高，阻碍了外源DNA的转入。有待进一步研究建立、完善HW-D3菌株的 遗传转化方法。 WA coli 803菌株为供体 7．为研究HW．D3菌株在环境中的检测，本实验以E 菌，以Ecoli 质粒转入受体菌HW—D3菌株中，但未取得成功。 杂交，杂交后的菌体亮度高，外形清晰，杂交率较高，表明HW．D3菌株细胞对该 探针有较好的渗透性，探针可以进入细胞与rRNA分子杂交，为后续实验设计特异 性探针进行杂交，进而在环境中原位检测HW-D3菌株提供了实验参数和技术基础。 关键词：毒死蜱，红球菌，pNC9501，转化，三亲接合，FISH n Abstract isin amountin O唱anophosphatepesticidechlorpyrifos，whichlarge a西砌tural a environmentaltoxicchemical production significant currently,is rhodochrousHW-D3Canbeusedforthe chiorpyrifosefficiently,Rhodococcus constructionof weretheresultsof geneticallyengineered microorganisms．nefollowing thisresearch． to 1．TheresistanceofHW-D3commonantibioticswas determined byusing anti