PRRSVJL%2f07%2fSW分离株GP5基因克隆和真核表达及间接ELISA方法的建立.pdfVIP

摘 要 根据猪繁殖与呼吸综合症病毒美洲型毒株 VR-2332 株的基因序列，设计了一对 GP5 基因特异性引物P1/P2 ，以PRRSVJL/07/SW 毒株细胞培养物为模板,利用RT-PCR 方法，成功扩增出GP5 基因，然后以pMD18-T 为载体对GP5 基因进行克隆。序列测 定结果表明，GP5 基因全长603bp，编码201 个氨基酸；序列分析表明，GP5 基因与 VR-2332 株和LV 株核苷酸同源性分别为91.6%及48.7% ，编码氨基酸同源性分别为 87.6%及60.0% 。 将GP5 基因亚克隆到pCI-neo 表达载体中，构建表达质粒pCI-GP5 。将重组质粒 转染 Marc-145 细胞中，用间接免疫荧光试验、SDS鉴定目的蛋白的表达。结 果表达出约25 KDa 融合蛋白，经Western-blot 免疫印迹分析，重组蛋白与抗PRRSV 的阳性血清发生特异性反应，表明其具有抗原活性。 用重组表达的融合GP5 蛋白作为包被抗原，经Western-blot 分析表明，该重组蛋 白可以与PRRSV 阳性血清反应并具有良好的反应性，以此纯化的重组蛋白建立了诊 断PRRS 的间接ELISA