ⅰ四川水稻立枯核菌的遗传分化与致病力研究;ⅱ水稻立枯丝核菌g蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析.pdfVIP

摘 要 亚门真菌，其分布广、寄主范围大，不产生无性孢子，常以菌核形态习居土壤， 是玉米、水稻、草坪草、马铃薯等农作物和纹枯病的致病菌。根据菌丝融合与否， 立枯丝核菌的AG．IlA亚群是水稻和玉米纹枯病的优势致病菌群，纹枯病在我国 长江流域高温、高湿条件下年年发生，是水稻和玉米等农作物年年减产的主要因 素之～。在四川，立枯丝核菌也造成水稻、玉米严重减产。因此，充分认识我省 水稻立枯丝核菌(R．solani)生理小种变化的特点，进行综合防治立枯丝核菌， 提高抗病育种水平显得尤其重要。 G蛋白是膜协同、异三聚体蛋白，由Q、13、Y3个亚单位组成。G蛋白及其 受体(GPCRs)组成了真核生物细胞罩最流行的信号系统、感官多样调节系统、 细胞生长和激素调节系统。G蛋白B亚基呈现出一种桶形B折叠结构，并包含 等研究表明，在真核生物中G蛋白B亚基基因参与信号传导途径，导致基因表 discoideum、Ustilagomaydis和Fusarium oxysporum中，G蛋白在整个代谢生 长过程中都起着举足轻重的作用，涉及细胞生长、分化和毒性等。Kasahara等 对Cryphonectria 因菌株的菌丝缺乏明显分叉，对植物侵染和致病力明显降低。 本研究从四川不同生态区分离到水稻立枯丝核致病菌55株，研究其遗传分 化、致病力分化和聚类分析，并利用同源克隆方法分离水稻立枯丝核菌G蛋白13 亚基基因，对其功能做了些初步的研究，为研究水稻立枯丝核菌致病机理和对应 防治方法奠定基础。实验主要结果如下： 1．通过水琼脂分离法共得到水稻立枯丝核菌菌株55株。 2．水稻立枯丝核菌菌丝融合：所有分离全部菌株中除D42都与标准菌株 AG一1IA发生菌丝融合。部分菌株不仅仅能与其中的一种标准菌株发生菌丝融合， 而且还能同时与其它一种或者多种标准菌株发生菌丝融合，这说明在细胞学水平 上，这些立枯丝核菌具有多个菌群归属性，因此这类立枯丝核菌为桥梁菌群。 3．水稻立枯丝核菌致病力鉴定：室内采用离体叶片接种法，分别接种X400、 蜀恢527R、蜀恢881R。结果表明，各菌株间致病力差异显著。田问采用始穗期 嵌入接种法，结果表明，各菌株间致病力差异显著。同时发现，相同菌株同时接 种三种材料时，室内离体鉴定方法的致病力对不同材料差异较小，而活体接种方 法表现出很大的材料间差异。 外的所有分离菌株与AG—l IA可聚为一类，而外群对照菌株A一1和另外9个国际 标准菌株分别归属一类。以相似系数0．941为标准，可以把55个水稻立枯丝核 D55为第6类；D42为第7类；D54为第8类。 cucuffleFisG 5．水稻立枯丝核菌G蛋白B亚基基因的同源克隆：利用衍生自Z 蛋白B亚基基因序列的特异引物，对水稻立枯丝核菌菌株DNA进行PCR扩增。 产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可以观察到一条约1．9kb大小的扩增带，与预期的 G蛋白13亚基基因大小相吻合。经测序表明该片段为水稻立枯丝核菌G蛋白13 亚基基因的扩增产物。softberry软件分析证实，该序列包含一个约1．7kb的完 整开放阅读框，编码366个氨基酸。 6．G蛋白beta亚基基因多态性及进化分析t对11个水稻立枯丝核菌菌株的G 蛋白13亚基基因氨基酸序列作同源性比较。结果发现，他们之间同源性较高， 但是，在某些区间发生变异。进化分析发现该序列与大量物种G蛋白13亚基基 因明显同源，一致性介于88．14-57．34％。 7．基因的表达模式分析：通过半定量RT-PCR法对水稻立枯丝核菌AG一1IAG 蛋白13亚基基因在不同时期的表达量分析显示，水稻立枯丝核菌G蛋白B亚基 基因在前2d几乎不表达，从第3天到第5天基因的表达量逐渐增大，在第5天 时达到最大，第6天后表达量陡然降低到几乎不表达。因此，水稻立枯丝核菌G 蛋白13亚基基因在对数生长期表达量最大，提示水稻立枯丝核菌AG一1IAG蛋白 B亚基基因可能具有时空表达特性。 关键词：立枯丝核菌；菌丝融合群；RAPD：聚类分析；致病力；G蛋白B 亚基基因克隆；表达 Abstract RiceRhizoctoniasolaniis