磺胺嘧啶人工抗和单链抗体的制备及特性研究.pdf

摘要 摘要 食品和生态环境中的磺胺类药物残留，不仅危害人类键康，而且造成巨大经济损失， 越来越受到人们的关注。建立磺胺嘧啶的快速、准确检测方法对食品安全，人类健康以 及打破发达国家技术壁垒具有重要意义。论文针对这一急需解决的重要问题，制备了磺 胺嘧啶人工抗体(Artificialantibody)，建立了分子印迹柱．高效液相色谱法检测食品样品 variable 中磺胺嘧啶残留的方法。同时进行了磺胺嘧啶单链抗体(Single-chainfragment， scFv)的研究，构建了单链抗体随机突变文库，以期从分子水平探讨更新、更快速准确 的方法。主要研究结果如下： 1．采用紫外吸收光谱法和1HNMR实验的方法研究了磺胺嘧啶模板分子和丙烯酰 胺功能单体之间的相互作用。结果表明，磺胺嘧啶和丙烯酰胺分子问会形成氢键作用， 并随着磺胺嘧啶浓度的增加，丙烯酰胺混合液的紫舞吸收会发生红移现象且吸收峰的强 度减弱。 2．采用本体聚合法制备了磺胺嘧啶分子印迹聚合物，并采扫描电子显微镜法、傅立 究磺胺嘧啶分子印迹聚合物的特性。结果表明，MIP表面含有大量模板分子被洗脱后所 留下的立体空穴，MIP的比表面积为182．2 m29-1，MIP的吸附容量为7．8mg儋。 3．采用单因素实验方法优化磺胺嘧啶分子印迹柱的固相萃取条件。结果表明，在 2．5％乙腈．水溶液(v／v)为萃取液，流速为2 mL／i，40％乙腈．水溶液(v／v)为洗脱 液，洗脱体积为3mL最佳的条件下，磺胺嘧啶分子印迹柱的萃取效率为99％。 4．建立了分子印迹柱．高效液相色谱检测猪肉中磺胺嘧啶残量的方法。结果表明， 在最佳固相萃取条件下，猪肉样品中磺胺嘧啶的浓度在50-4000 pg／kg范围内，检测线性 ug／l(g， 检出限为10 ttg／kg，加标回收率≥75．6％，相对标准偏差≤6．1％。 物信息学方法分析磺胺嘧啶单链抗体的结构特性。结果表明，磺胺嘧啶单链抗体的重链 DNA 和轻链的可变区均含有鼠源的3个CDR区和4个FR区；NCBI Blast未见相同 序列，但重链可变区基因与鼠源的IGHVI．1401酶同源率达83．7％，轻链可变区基因 性指数为一0．484，不稳定系数为49．38，该单链抗体属于不稳定蛋白。 6．采用分子生物技术与基因克隆技术构建了磺胺嚏啶单链抗体的原核表达载体 摘要 pET22b-SD，并将其转化至E．coli BL21(DE3)中，采用单因素实验方法优化了重组菌株 E．coli BL21(DE3)的表达条件。结果表明，重组菌株E．coliBL21(DE3)以包涵体形式表 达了磺胺嘧啶单链抗体：诱导表达的最佳条件为诱导温度为30℃、IPTG诱导浓度为300 7、装料系数为30％和诱导时间为8h；蛋白印迹和酶联免疫吸附实验表明 州、起始pH 磺胺嘧啶单链抗体具有生物活性。 7．采用基因克隆技术将磺胺嘧啶单链抗体基因克隆至分泌型pPIC9K表达载体中， 并转化至毕赤酵母GSl 15。结果表明，MM平板和MD平板筛选获得Muts型毕赤酵母 GSl 15重组子，含G418抗生素的YPD平板筛选获得多拷贝毕赤酵母GSl15重组子； 在甲醇诱导下，多拷贝毕赤酵母GSll5重组子表达了磺胺嘧啶单链抗体。 8．采用易错PCR技术构建了磺胺嘧啶单链抗体随机突变噬菌体文库。结果表明，