利用拟南芥液泡nalt;#39;+gt;hlt;#39;+gt;逆向转运蛋白基因（atnhx1）改良马铃薯耐盐性的研究.pdfVIP

摘要 土壤盐渍化已成为危害农作物生长、土壤荒漠化和自然生态环境恶化的主要 原因之一。由于许多农作物是非嗣盐的甜土植物，缺乏有效的耐赫机制，致使它 们在盐渍化土壤上不能正常生长，甚至死亡。因此，培育具有经济价值的耐赫作 物新品种，使其在盐渍化士壤上生长或在改良后的盐渍化土壤上生长，是有效利 用广袤盐荒地的最佳途径。 随着植物耐盐机理深入探知，特别是酬盐相关基因的分离和功能的认知以及 基因工程育种技术的成熟，开辟了培育涮赫植物品种的新途径，陆续获得了一些 靠传统方法而不能获得的耐盐植物新品种(品系)，在盐渍化土壤的利用上发挥着 作用。植物细胞对盐胁迫的适应性主要是通过在细胞质中积累有机溶质、离子在 液泡内区隔化和将过多的Na+通过质膜向细胞外排放等几方面的作用来实现的， 其中Na+的外排和区隔化是通过质膜或液泡膜上的Na+／H+逆向转运蛋白来完成 的，特别是Na+的区隔化可将进入细胞的无机离子吸收并储存在液泡中，使液泡 更好地发挥其渗透调节功能，而成熟的高等植物细胞中液泡又占完全膨胀细胞总 体积的95％。所以，Na+的区隔化是植物在盐环境下生存的必要保障，是较有机 物质积累对植物涮赫所起作用更为有效的方式。 本研究的主要目的是从拟南芥中克隆液泡膜Na+／H+逆向转运蛋白基因 35S或逆境诱导型启动子rd29A融合，构建 (AtNHXl)，与组成型启动子CaMV 35S 成不同启动子驱动AtNHXI基因的植物表达载体。通过农杆菌介导，将CaMV 启动子驱动的AtNHXl基因转入洋葱表皮细胞和模式植物烟草中，以确证 AINHXl基因的功能。然后将携带目的基因的两种表达载体转入马铃薯中，从而 提高其耐盐性。目前，取得的研究结果有： 1、以NaCl胁迫处理的拟南芥幼苗叶片为材料，用TRIzol一步法RNA提取 试剂盒抽提总RNA，通过RT-PCR方法和DNA序列测定，证实获得了拟南芥 括538个氨基酸编码区和1个终止密码，具有多个物种Na+／H+逆向转运蛋白基因 序列同源性分析结果显示，该eDNA片段与原序列的同源性高达99．75％，与同科 芸薹属油菜的同源性为89％，但与不同科植物的同源性较低，仅为60％～70％， 表明该基因在进化上存在多样性，但它们都具有氨氯砒嗪脒结合位点，对Na+具 有高度专一性，对植物的耐盐性起着重要作用。 2、将rd29A基因的启动子与GFP基因融合，构建成植物表达载体，并以 CaMV35S启动子驱动GFP基因的表达载体为对照，用基因枪介导转化置于4种 类型培养基上的洋葱表皮细胞。对其进行不同温度下的培养，16h后观察GFP基 因的瞬时表达水平。结果表明，rd29A启动子同CaMV 35S启动子一样，具有启 动子的各种作用元件，能够驱动它所调控的目的基因——GFP基因的表达。且在 不同培养基上，该启动子驱动的GFP基因的表达量均高于CaMV35S启动子驱动 的GFP基因的表达量，并对高盐和脱水逆境的响应较温度显著。说明该启动子可 以在抗逆基因工程中用于目的靶基因表达的调控。 序列分析发现，两个酶切位点的添加是成功的，但扩增的终止子序列与原序列的 同源性间有差异，即有四个碱基发生了变异，特别是第17个碱基位点出现了缺失。 利用绿色荧光蛋白(GFP)对改造载体进行了终止子活性的检测，结果发现，它 rd29A启动子驱动AtNHXl基因的植物表达载体。 分析发现，终止密码的删除是成功的，且扩增产物与原序列间的一致性为100％。 将该基因的c端与GFP基因连接(启动子为CaMV35S)，通过PCR和酶切检测 证实，两个基因连接成功。利用基因枪介导法将其转入洋葱表皮细胞中，结果发 基因的表达产物被定位在细胞的液泡膜上，且该基因对盐逆境具有明显的抗性。 5、将CaMV35S驱动的AtNHXl基因表达载体通过农杆菌介导法转入烟草 杂交检测，证明AtNHXl基因己整合到烟草的基因组中并在转基因植株中得到转 录。对转化植株的耐盐性初步分析发现，转基因植株在1％NaCl的培养基上生长 正常，在1．5％NaCl的培养基上也有一定长势。而非转基因植株在≥1％NaCI胁 迫下，植株生长基本受阻，表现为无根的发生，叶片萎蔫，叶缘周围产生枯死组