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* miR-375调控肝癌细胞能量代谢的作用及分子机制研究 *本研究得到国家自然科学基金（编号资助。 答 辩 人：许鑫森 专 业：临床医学（七年制） 导 师：刘 昌 教授 硕士研究生答辩 1 研究背景 2 研究目的 3 研究方法 4 研究结果 5 结果讨论 6 结论与展望 答辩内容 肝癌细胞作为生长增殖失控的细胞，其重要的生物学标志是能量代谢异常。 以糖酵解水平增强为主要表现（即“Warburg effect”）的糖代谢通路异常是其中的核心环节。 Warburg效应的发现，将肿瘤特有代谢异常问题提到了重要地位。该现象目前被认为是肿瘤细胞恶性转化中的基础代谢改变，并被应用于肝癌的临床诊断和靶向治疗 1 研究背景-Warburg effect 1 课题背景-miRNA microRNA作为影响基因转录后翻译的重要因子，具有调控肿瘤细胞代谢的重要功能。 1 研究背景-miRNA 基于这一思路，本论文拟通过生物信息学筛选和分子生物学实验，探讨线粒体相关miRNA对于肝癌代谢的影响。 目前报道的肿瘤能量代谢相关miRNAs仅数十个 能量代谢作为一个巨大的调控网络，现有报道能否充分解释其复杂的调控机制？ 尤其是在线粒体能量代谢的调控过程中，是否需要更多的miRNA参与？ 2 研究目的 细胞恶变的能量基础 3 研究方法 96对肝癌组织标本芯片 ----数据从GEO网站获取 miR-375细胞转染 靶基因预测数据库 ----miRanda、miRDB、miRWalk、Targetscan Affymetrix表达谱芯片 Real-time PCR、BCA蛋白定量、葡萄糖乳酸检测、MTT检测、线粒体DNA拷贝数检测、线粒体荧光探针 通过96对肝癌组织标本芯片筛选出5个与线粒体代谢功能相关且在肝癌中差异表达的候选miRNAs miRNA名称 基因定位 肝癌中表达情况 （肝癌/正常） MNEGs中被证实靶基因数目a miRNA与MNEGs的相关性 NCI-60 肝癌标本 miR-375 2q35 0.18 6 0.0001 0.0032 miR-200b 1p36.33 0.20 2 0.0007 0.0001 miR -188 xp11.23 2.34 1 0.0001 0.0156 miR -18a 13q31.3 2.61 1 0.0168 0.0001 miR -96 7q32.2 3.89 2 0.0003 0.0382 调控肝癌代谢的潜在miRNAs 4 研究结果-筛选miRNAs miR-375与MNEGs和Genome的相关系数 调控肝癌代谢的潜在miRNAs 4 研究结果-筛选miRNAs miRNA-375最早由Poy MN等于2004年在Nature杂志报道。随后的研究表明，miRNA-375与2型糖尿病以及胰岛素耐受相关，并能够影响胰岛细胞的发育和调控胰岛素的释放，参与全身糖代谢水平的调控。 对7种肝癌细胞系进行miR-375表达检测 正常组织与肿瘤组织 4 研究结果-miR-375的RT-PCR验证 实时定量PCR 转染细胞组中miR-375表达水平显著上调 RNA浓度 琼脂糖凝胶电泳 4 研究结果-细胞转染 乳酸 葡萄糖 胞内 胞外 miR-375促进乳酸生成，抑制葡萄糖产生 4 研究结果-影响代谢 Mito-Tracker Green是一种线粒体绿色荧光探针 用于活细胞线粒体特异荧光染色 定位于线粒体的能力不受线粒体膜电位影响 4 研究结果-影响线粒体 实时定量PCR 检测mtDNA拷贝数（T） 检测单拷贝数基因HGB拷贝数（S） 计算每个样本二者的比值（T/S） 3 miR-375表达调控-影响细胞活性 4 研究结果-影响活性 利用多个miRNA靶基因预测网站（miRanda，miRDB，miRWalk以及Targetscan）对分析结果进行验证，能够佐证miR-375靶基因的预测结果。 通过miRanda软件发现 miR-375与PDHK1、LDHB、ACSL4以及OCTN1关系密切，能够结合到上述分子的3’UTR区域。 4 研究结果-靶点预测 热力学模型对miR-375与4个靶点基因的结合能量改变进行预测 miR-375与上述4个基因mRNA结合耗能较少，结合之后miR-375复合体能够处于更加稳定状态 4 研究结果-靶点预测 4 研究结果-RT-PCR验证 PDHK1 ACSL4 OCTN1 LDHB 4 研究结果-Affymetrix芯片 AHCYL1 DUS3L MLLT4 RPS15A ARID1B DUSP9 MTMR2 S100A11 ARL2BP FAM151B NDRG4 SH