外源基因的表达创新.pptVIP

原核表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 （一）真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞等） 二、外源基因在真核细胞中的表达 （二）真核表达载体大多是穿梭载体, 通常包括以下元件： 1．启动子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。 2．增强子 3．剪接信号 4．终止信号和PolyA化信号 5．遗传选择标记 ：胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。 （三）外源基因导入宿主细胞(转染或感染) 新霉素的类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的neor基因编码的磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含neor基因的载体后，转染细胞就可以在含有G418的培养基中生长而得以筛选。该选择系统适用于所有真核细胞。 新霉素抗性选择系统 （四）转染细胞的筛选 酵母表达系统: 酵母（yeast）——是一类以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核生物，是外源基因最理想的真核生物基因表达系统。 酵母菌的特点： 基因表达调控的机制比较清楚，遗传操作相对简便，并于1996年完成了对酿酒酵母基因组全序列的测定； 具有原核生物所不具备的蛋白质翻译后加工和修饰系统； 可将外源基因表达产物分泌到培养基中； 对人体和环境安全，不含毒素和特异性病毒； 可进行大规模的发酵，工艺简单而成熟，成本低廉。 真核表达体系——实例： 酵母、昆虫、乳类动物细胞等 哺乳动物细胞基因表达系统: 哺乳动物细胞是最高等的真核生物细胞，其结构、功能和基因表达调控更加复杂。要表达具有生物学功能的蛋白质和具有特异性催化功能的酶，需要在高等真核生物细胞中进行。外源基因在哺乳动物细胞中的表达包括基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质加工等过程。 7.3.6.1 哺乳动物基因表达载体的组成特征 哺乳动物基因表达载体 质粒载体 病毒载体 哺乳动物基因表达质粒载体是一类穿梭质粒，能够在细菌（大肠杆菌）和哺乳动物细胞中进行扩增。 哺乳动物基因表达宿主细胞 哺乳动物基因表达宿主细胞选择的基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好。 在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特性尽可能接近的肿瘤细胞常被选择为基因转移的受体细胞。 目前用作哺乳动物基因表达系统的受体细胞主要有：CHO-K1细胞、COS细胞、鼠骨髓瘤细胞等。 CHO-K1细胞 CHO-K1细胞是从中国仓鼠卵巢中分离出的一株上皮细胞。目前被用于基因表达的受体细胞是一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr－）的突变株，它可在氨甲蝶呤选择压力下，使外源基因拷贝数扩增并得到较高水平的表达，表达量可达10μg/ml以上。 ①外源基因在没有选择压力的情况下能稳定保持； ②适合多种蛋白质的分泌表达和胞内表达； ③对培养基的要求较低，可在无血清培养基中培养； ④细胞可进行贴壁培养，也可进行大规模悬浮培养。 该细胞株是目前应用最广泛的哺乳动物基因表达受体细胞之一，已有多种外源基因如人组织型纤溶酶原激活剂（tPA）、干扰素β、干扰素γ 、凝血因子Ⅷ等在CHO细胞中得到表达。 CHO-K1 细胞特点 COS细胞 它来源于非洲绿猴肾细胞系（CV-1），能组成性表达SV40的大T抗原。 COS细胞的特点： ①细胞来源丰富； ②细胞易于培养和转染； ③能使转染到该细胞中的带有SV40复制子的转录载体快速扩增； ④能瞬时大量表达外源基因的产物。 由于转染质粒在COS细胞中无节制复制，最终将导致细胞无法忍受而死亡。利用COS细胞作为外源基因瞬时表达的受体细胞可广泛用于哺乳动物基因的表达与调控、蛋白结构与功能分析等研究。 鼠骨髓瘤细胞 鼠骨髓瘤细胞如Sp2/0、NSO和J558L等已被用作基因表达的受体细胞。目前已有免疫球蛋白（Ig）、tPA等多种外源基因在鼠骨髓瘤细胞中得到表达。 鼠骨髓瘤细胞的特点： ①细胞易于培养和转染，可在无血清培养基中进行高密度悬浮培养； ②能进行分泌表达，且表达量高； ③能对蛋白质进行糖基化修饰。 基因表达产物的检测 外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。 检测特异性mRNA的方法 Northern杂交法 检测特异性蛋白质的方法 生化反应检测法 免疫学检测法 生物学活性检测法 当转化的外源目的基因表达产物没有可供直接检测的性质时，可把外源基因与标记基因或报告基因一起构成嵌合基因，通过检测嵌合基因中的标记基因或报告基因间接确定外源目的