利用抑制消减杂(ssh)技术筛选及乙烯利诱导黄瓜茎尖雌性表达相关基因.pdf

摘要 摘要 sativus 黄瓜(Cucurms 实供食用，结果能力强，产量高。应振士等(1990)认为黄瓜是研究植物性别决定和性别分 化的好材料。黄瓜为雌雄同株植物，性器官的败育发生在形态发生晚期，单性花的性别决定 取决于植物个体的基因型与环境条件的相互作用。 影响黄瓜性别的基因中起主要作用的是埘、F和么基因。但不论作用多强，其表达也要 受到其他基因和环境的影响。黄瓜的性别决定对植物生长调节剂处理非常敏感，适宜的植物 生长调节剂处理可使黄瓜的性别向不同的方向转化。乙烯利(或乙烯)可使植株雌性化，乙 烯的作用看来是明确而且关键性的，其作用位点是茎尖。并且许多因素可以影响植物生长调 节剂对性别的作用，如处理时的发育时期，植物生长调节剂处理的浓度和处理次数，环境因 素(特别是温度和光周期)等。 虽然利用遗传分析已对黄瓜的性别决定遗传有一些了解，但有关性别基因作用的机理、 细胞遗传以及植物激素(尤其是乙烯)是怎样参与调控性别决定过程等方面的研究尚少报道。 因此，要用分子生物学的方法分离出有关的基因，仍需大量的工作。 本研究以黄瓜雄性系品种D06103为试材，利用150 mg／L的乙烯利处理黄瓜两叶--,9时 建性别决定时期乙烯利处理的黄瓜茎尖eDNA文库，筛选乙烯利诱导黄瓜雌性表达相关基因， 并对文库筛选出的11个基因进行了表达分析。在此基础上利用电子克隆技术克隆出3个黄瓜 雌性表达相关基因的eDNA全长，并分别对其组织特异性表达进行了研究。 试验结果如下： 1．确立了外源激素乙烯利对黄瓜两叶--,9时期的诱雌效果最佳的浓度为150 mg／L，并 且不同浓度的乙烯利对黄瓜第一雌花节位影响不显著，但是对植株上雌花占总花数的百分比 影响差异显著。乙烯利诱导后黄瓜雌、雄花芽扫描电镜观察发现，雌花中的雄蕊发育后期受 到抑制，而雄花发育正常。 克隆，利用CAP3软件进行聚类和拼接，获得乙烯利诱导后特异增强表达的UniESTsl03个， 可以找到已知的同源序列，占全部EST的96．1％；4条没有显著匹配结果，占全部EST的3．9％。 用GeneOntology进行功能分类发现除未知功能外，很多基因涉及新陈代谢(尤其是光合作用) 还有蛋白质合成、细胞间通讯和能量代谢等过程。 3．对文库筛选得到的部分基因进行组织特异性表达分析，根据分析结果推测乙烯信号转 及光合作用相关基因CS-RBCL和CS-CAB8与黄瓜乙烯利诱导后的雌性表达密切相关。 4．克隆了黄瓜CS-EBFl基因，并对其蛋白质结构进行了预测。基因编码区全长为1964bp， 编码640个氨基酸。该基因与拟南芥中的EBFl基因有67％的核苷酸序列相似性。蛋白含有部 摘要 分F．box保守区域和LRRs区。CS-EBFl基因的表达分析表明在根、茎、叶、茎尖都受到乙烯 利的诱导表达，并且在雌花芽中表达强于雄花芽，推测其与黄瓜雌花发育密切相关。 5．克隆了黄瓜CS-SA腿因，并对其蛋白质结构进行了预测。基因编码区全长1545 bp， 编码485个氨基酸。黄瓜CS．SAHH氨基酸序列与苜蓿的同源性为63％。该基因编码的蛋白有 两个S．腺苷．L．高半胱氨酸水解酶活性功能区。基因表达分析表明，其在乙烯利诱导的黄瓜茎 尖中表达增强，而在雄花的雄蕊中表达弱于雌花的各个部位。推测甲基化修饰作用参与黄瓜 雄蕊的发育。 6．利用生物信息学手段克隆了黄瓜CS-PO基因，该基因开放读码区为791bp，编码237个 氨基酸。该蛋白可能存在2个凝血因子C区域标记和2个表皮样生长因子位点标记。2个凝血因 子结合位点表明其与能量代谢有关，表皮样生长因子位点则是底物的结合位点。对CS-PO基 因的表达分析表明，其在雌花发育初期的雌花芽和幼果中表达较强。 关键词黄瓜；雌性表达；SSH：eDNA文库；ESTs；克隆 Abstract Identificationof