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柑橘碎叶病RT—PCR检测及脱毒技术研究 柑橘碎叶病RT．PCR检测及脱毒技术研究 摘要 TatterLeaufVims 柑橘碎叶病(Cinlls DiseaSe，简称CTL，v)是一种重要的柑橘病 害，在田间，以枳或者枳橙做砧木的柑橘受碎叶病毒侵染后表现明显症状，以其他 品种做砧木的植株上症状不明显或不表现症状，因而该病在生产上容易隐症带毒传 播。目前检测柑橘碎叶病的方法有指示植物、聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子检测，其 中lH．PCR是一种快速检测柑橘碎叶病的方法，国内已有应用，但广西尚未有开展 这方面研究的报道。广西是我国的柑橘主产区，有的柑橘品种如天草受柑橘碎叶病 毒为害严重，影响到我区柑橘生产。为了快速了解田间柑橘植株、引进的柑橘品种 和苗木感染碎叶病情况，急需建立一套快速准确的柑橘碎叶病检测方法。热处理结 合茎尖嫁接在国内外已被证明为脱除柑橘碎叶病的先进有效方法。但传统的热处理 盆栽植株的方法对设备和空间要求较高，步骤较繁琐。为了寻找一种简便有效的热 处理脱毒方法，本论文开展了利用生长调节剂处理插条再进行高温高湿培养进行脱 毒的研究。本论文的主要研究结果如下： l、运用改良的Bugos法进行大量样品高质量I冰A的快速提取。进行了RT-PCR 的优化实验，从引物、引物浓度，dNTP浓度、退火温度等方面对RT．PCR进行优化， 优化后的RT．PCR能非常稳定的检测出阳性对照中的CTLV，灵敏度高、特异性强， 适合对大量田间样品的快速检测。 2、采用RT．PCR技术对广西部分栽培品种、越南品种、中越边境样品、无黄龙 病苗木以及脱除黄龙病的接穗进行碎叶病快速检测，结果表明：6个供试的广西柑 橘栽培品种中有2个带病。14个越南品种中没有带病。中越边境采集的6个样品中有 1个带病。宫川、宫本、市文、山下红、日南一号、山川、兴津7个品种，有2株兴 津品种检测出CTLv。从广西某单位采集33个已脱除黄龙病的柑橘品种(系)接穗 嫁接在网室的实生枳壳苗上，经IU．PCR检测，检测出南丰蜜桔和兴津携带碎叶病 病毒。 3．试管砧木苗的培养过程中剥除种皮可显著提高枳壳无菌萌发的发芽率。剥除 内、外种皮处理为最优处理，发芽率为96．7％。枳壳种子用150IBA浸泡处理 mg／L 柑橘碎叶病RT—PCR检测及脱毒技术司”；巴 后，再无菌培养发芽率更高，可达99．4％。 4．插条用不同生长调节剂浸泡扦插后，经过光照培养箱高温热处理40天，不 IBA浸泡 同生长调节剂种类及不同浓度处理的插条萌芽率为53％到90％，100mg／L 处理的插条萌芽率最高，达到了90％，生根率达到了57％。柑橘插条热处理脱毒过 程中，能够大量萌芽，可以达到热处理的目的。本试验认为，生长调节剂处理插条 再进行高温高湿培养，是一种简便、有效、实用的热处理方法。 关键词：柑橘碎叶病；ImPCR；茎尖嫁接；扦插；热处理 II 广西大掌硕士论文 柑橘碎叶病RT—PCR检测及脱毒技术研究 andEIiminationTech of onRT·PCRDetection nique Study CitrusTatterLeafDisease YuIlwei Zhang 530004，China) (CollegeofA西culture，GuangXiUniVersi吼Nanning