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利用原生质体融合技术进行米曲霉新菌株的选育 食品科学专业 研究生唐洁指导教师车振明 摘要 米曲霉(Aspergillusoryzae)是酿造业中的重要微生物，在其生长过程中 能分泌多种酶系，其中较重要的是蛋白酶，可将豆类中的蛋白质降解成多肽、 氨基酸等可溶性氮物，对酱油、豆瓣、米酒等的产率和风味起着重要作用；然 而现在工业用米曲霉菌株蛋白酶活性高的往往生长速度慢，生长速度快的菌株 往往蛋白酶活性低，这就大大降低了生产效率，影响了生产质量。所以目前我 国的酿造业中，米曲霉菌株的选育是个热点。现在国内对米曲霉菌株的选育方 法主要采用物理和化学的诱变，但是诱变工作量大，随机性也较大，不易得到 理想菌种。针对生产实践中的这一情况，本试验通过原生质体融合方法来选育 生长速度快且蛋白酶活力高的新菌株。原生质体融合，就是将双亲株的微生物 细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加 入物理的或者化学的或者生物的助融条件，使双亲株的原生质体间发生相互凝 集，通过细胞质融合，核融合，而后发生基因组间的交换重组，进而可以在适 宜的条件下再生出微生物的细胞壁来，再通过合理的筛选程序，从再生细胞中 获得重组子的过程。 本试验选取了生长速度快但蛋白酶活性低的米曲霉菌株As3．951和生长速 度慢但蛋白酶活性高的米曲霉菌株CICC2339作为原始亲本菌株。首先选用纤 维素酶、溶壁酶、蜗牛酶以7：3：1比例混合配成复合酶对其细胞壁进行酶解 制备原生质体，其原生质体形成量约为100个／ml；然后选用紫外、微波及超声 波三种不周的灭活方法进行双亲灭活，探讨每种灭活方法的最佳条件，并通过 所得融合子的性状选出最适合米曲霉的灭活方法。结果发现米曲霉菌株 融合子性状最好。在选取最佳灭活方法的基础上，我们采用了原生质体电融合， 探讨了电融合的最佳条件，即成串脉冲频率1MHz，成串电压40V，融合脉冲 电压400V，脉冲宽度801as，脉冲个数6个；通过电融合初筛出一批新菌株， 并与传统PEG融合法选育出的菌株进行了性状上的比较；最后对初筛出来的 米曲霉菌株进行传代实验，每隔两代通过福林一酚法测定其蛋白酶活力的高 为6540 u幢、7680u／g、6500u／g。这三株融合株既具备亲本菌株AS3．951生长 速度快的特点，又具备亲本菌株CICC2339蛋白酶活力高的特点，同时遗传稳 定；其中，融合株EFll3的蛋白酶活力还高于CICC2339。 关键词：米曲霉，蛋白酶，灭活原生质体，原生质体电融合，融合子 Aresearchon newstrainof screening with fusion oryzaeprotoplast FoodScience Speciality Jie Advisor Che PostgraduateTang professorZhenming Abstract isthe in oryzae Aspergillus importantmicroorganismthe自ctoryofbrewage．It excretedkinds its of them,the many of嗣l驴eduringprocessgrowth．Among most is whichcall the into importante／1zymeprotease legume