egcg与铜离的相互作用及其细胞生物学行为.pdfVIP

致谢 本论文是在沈生荣教授悉心指导下完成的。在五年研究生生涯中，导师以其渊博的 知识、活跃的学术思想、严谨的研究态度指导我在求知的路上不断前进，带领我领略学 术殿堂的无限奥秘。在本实验的设计及对实验结果的分析过程中，导师新颖的观点、独 特的思维方式和敏锐的观察力更使我受益良多。在生活上，沈老师是我的恩师也是良友， 对我无微不至的关怀使得漫漫求学路充满温馨和感激。在此向我的恩师表示最诚挚的感 谢! 本实验的部分内容在美国FDA和浙江大学其他院所实验室完成的，期间得到了多位 Yin对自由基测定实验的进行提供了极大的帮助， 老师的帮助。美国FDA的Dr．Jun-jie ESR技术测定由他在美国FDA生物物理实验室完成，并在实验数据及论文整理过程中给 予了很多热心指导；生物医学工程学院的叶剑锋博士为流式细胞仪实验部分的进行提供 了方便；在酶标仪的使用方面得到了动物科学学院孙红祥副教授的热心帮助；生物化学 研究所朱诚刚老师在实验前期提供了细胞培养的场所；中心实验室黎军英老师为透射电 镜的使用提供了方便。在此对帮助过我的各位老师表示衷心的感谢! 感谢陈子元院士对实验进展的关心及在学习和学术方面对我的谆谆教诲。感谢本系 梁月荣教授、陆建良副教授、黄志根副教授、汤一副教授等老师的关心和帮助。感谢本 实验室陈留记博士、金超芳硕士、唐德松硕士、张玉艳硕士、陈勋硕士、洪军同学、贾 俊辉同学，同寝室的于翠博士、卢觅佳博士在五年求学生涯中给予的生活和学习上的帮 助，是你们为我营造了愉快、温暖的学习和生活环境，谢谢! 最后，衷心的感谢疼爱我的父母和姐姐，是你们无私的奉献使我在求学的路上安心 前进，感激之情无以言表! 谨以此文献给帮助、关心过我的热心的人们! 摘要 据调查，在欧美，人类因患前列腺癌引起的死亡率现已位居第二，仅次于肺 癌。据流行病学调查、细胞和动物实验研究初步证实EGCG具有一定的预防、 治疗前列腺癌的作用。铜离子是人体必需的微量元素，过量积累或缺乏会导致多 种疾病的发生，包括癌症。金属离子与儿茶素的相互作用是近年来茶叶生物化学 和生物无机化学的研究热点，而铜离子与EGCG的相互作用及其细胞生物学行 为至今国内外少有报道。 本文利用前列腺癌细胞(包括激素依赖型前列腺癌细胞LNCaP和非激素依 赖型前列腺癌细胞PC一3)培养体系研究了EGCG、Cu”对前列腺癌细胞生长的 影响和损伤机理；EGCG与Cu2+共存对前列腺癌细胞生长的影响，及两者生物学 活性的变化；细胞培养条件下EGCG含量变化速度；EGCG、Cu2+存在及两者共 存时，F-12培养液发光强度的动态变化和自由基的产生情况。 生长，并与剂量呈正相关，EGCG与Cu2+抑制作用的最佳作用时间均为24小时； 毒性有一定的抑制作用，否则促进细胞死亡；在Pc一3细胞培养体系中，cu”存在 后加入Cu”时，Cu2+对EGCG诱导的细胞毒性有极显著促进作用，在同样水平下， 诱导的细胞毒性明显减弱，但高浓度EGCG对低浓度Cu2+诱导的PC．3细胞的毒 性无影响，只有高浓度Cu2+诱导的PC．3细胞的毒性才能被抑制。当后加入EGCG 而PC．3细胞体系中，EGCG对Cu2+诱导的毒性无影响。凝胶电泳及流式细胞仪 测定结果表明，坏死是导致LNCaP细胞和PC．3细胞生长受到抑制的主要原因。 利用透射电镜观察，发现处理后的前列腺癌细胞多数呈坏死症状，细胞膜有不同 程度的损伤，细胞膜是EGCG、Cu2+或两者相互作用时对细胞损伤的主要作用位 点。 速下降，且培养液中EGCG含量变化与其在不含细胞的培养液中的变化不同， 另外，不同的细胞株，EGCG含量变化也不同。在PC．3细胞培养体系中，EGCG 6小时后完全消失，而在LNCaP细胞培养体系中，6小时后仍可检测到微量的 浓度有关。在细胞培养体系中， Cu2+存在下，6小时EGCG全部消失，这可能 与EGCG较易被PC一3细胞吸收，通过胞内、胞外两种机制发挥作用有关。EGCG 细胞在胞内起作用，而EGCG的各种金属络合物也许是胞外作用的重要物质。 化学发光结果表明，EGCG、cJ+均能增强F．12培养液的发光强度，但增 强度均较单独作用时不同，变化的程度与加入浓度、加入顺序和作用时间有关。 共存时，无论加入顺序如何均可产生-OH自由基。但随着加入顺序改变，·OH自 由基信号强度发生变化，表明EGCG