毛细管电泳监测胞凋亡过程中蛋白酶的活化过程.pdf

摘 要 毛细管电泳（CE ）是一种高灵敏、高分辨、高速度、低样品消耗的微分离分析 技术，已在生物、医学、制药、环境卫生、食品等方面得到了深入的应用，尤其是在 生命科学领域。而蛋白组科学是现今生命科学研究中的重点之一，其中，酶活性研究 更是研究者们关注的热点前沿。许多重要疾病的发生发展与酶的异常活动密切相关。 Caspase 是一类死亡特异性蛋白酶家族，可通过两种基本的途径——线粒体途径 和死亡受体途径，介导细胞凋亡。其中 Caspase-3 是两条凋亡途径的汇合点。而 Caspase-2 在凋亡中的作用一直都存在很大的争议。本文用CE 监测了细胞凋亡过程中 Caspase-3 和Caspase-2 的活化过程，且Caspase-2 的催化速度与Caspase-3 相比有明显 的突跃，为抗肿瘤药物筛选与评价提供了一种全新的方法。 为了监测细胞凋亡过程中蛋白酶Caspase-3 的活化过程，作者采用了一种融合荧 光蛋白探针（ECFP-DEVD-DsRed ）作为Caspase-3 的底物。用荧光共振能量转移分子 成像方法证明了此融合荧光蛋白在HeLa 细胞质内表达的稳定性与可靠性。当用一定 剂量的顺铂诱导HeLa 细胞时，凋亡发生，Caspase-3 被激活，其荧光底物被酶切成两 部分。用CE 在体外分析了一系列不同诱导时间的HeLa 细胞裂解液，定量描述了凋 亡过程中Caspase-3 的活化过程。为获得满意的分析结果，我们优化了CE 分离条件， 如缓冲液类型、pH 值、浓度和分离电压。由于二元荧光蛋白探针的使用，强化了产 物与底物之间的差异，使CE 分离更容易，并且能够进一步验证实验结果的可靠性。 同样，为了监测细胞凋亡过程中蛋白酶Caspase-2 的活化过程，作者采用了另外 一种融合荧光蛋白探针（ECFP-VDVAD-DsRed ）作为Caspase-2 的底物。当用一定剂 量的顺铂诱导HeLa 细胞时，凋亡被启动，Caspase-2 被激活，其荧光底物被酶切成两 部分。通过 CE 分析一系列不同诱导时间的 HeLa 细胞裂解液，得出凋亡过程中 Caspase-2 的活化特性曲线。最后对单个HeLa 细胞凋亡过程进行了荧光分子成像，与 CE 分析群体细胞方法进行了对比。 关键词：毛细管电泳 蛋白酶活化过程 Caspase-3 Caspase-2 细胞凋亡 I Abstract Capillary electrophoresis (CE) is a micro separation technique for analysis, with many advantages of high sensitivity, high resolution, high speed, and minute sample cost. It has been applied in many fields, such as biology, medicine, pharmaceutics, environment and food, especially in the field of life sciences. Protein science is now one of focuses of life sciences, in which much attention has been paid to the activity of enzyme. Many important diseases are involved with abnormal activity of the enzymes. Caspase is a family of death-specific proteinase, which functions in two major signaling pathways, surface death receptors mediated and mitochondria initiated pathways. No matte