牡蛎蛋白肽的酶制备及其改善小鼠学习记忆功能的研究.pdfVIP

牡蛎蛋白肽的酶法制备及其改善小鼠学习记忆功能的研究 摘 要 本研究以近江牡蛎为原料，选用中性蛋白酶水解牡蛎蛋白制备牡蛎蛋白酶解肽；初步探 讨改善学习和记忆功能与抗氧化活性之间的联系；采用膜分离、凝胶层析分离等技术对牡蛎 蛋白酶解肽进行分离纯化；探讨了超滤组分对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的改善功能及 机制，最后对分离组分的理化特性及PC12 细胞活性进行研究。旨在提高牡蛎蛋白资源利用 率，开发新的功能食品，为牡蛎资源高值化利用开辟新途径。 （1）研究前处理方法、E/S 、pH 值、温度和时间对中性蛋白酶水解牡蛎蛋白的影响， 制备牡蛎蛋白酶解肽（EHOP ），分析其分子量分布，体外试验测定其抗氧化活性。结果表明： 酶解前100℃热处理10min 能够提高酶解液中蛋白肽的含量，E/S 为2.0% 、pH7. 0 、温度50℃、 时间3.0h 为酶解的适宜条件，其DH 达到14.95%，所制备的EHOP 的主要成分为小分子肽类 物质，分子量主要集中在500～3091Da 。EHOP 的还原性较强，对•OH 和超氧阴离子自由基 均有较好的清除能力，EHOP 浓度为25mg/mL 时，其还原力A700 为0.44，•OH 清除率和超氧 自由基清除率分别达到21.2%和68.9% 。 （2 ）采用动物实验探讨EHOP 改善小鼠空间学习和记忆能力及其抗氧化活性。EHOP 按 剂量5g/kg.d 给4 周龄小鼠灌胃4 周后，通过Morris 水迷宫方法考察了EHOP 对小鼠空间学 习和记忆功能的影响，并检测小鼠血浆、肝组织和脑组织中SOD 活性及MDA 含量。结果表 明，与空白组相比，EHOP 组小鼠的潜伏期（18.97±3.84s ）明显缩短，采用空间搜索策略的 比例、穿越平台的次数、目标象限停留的时间和路程均有不同程度的增加，证实EHOP 具有 显著改善小鼠学习和记忆功能。与空白组相比，EHOP 能够显著增强小鼠肝组织中SOD 活性 （P0.005 ），显著性减少脑组织及血浆中的MDA 含量均（P0.005 ），结果显示，EHOP 体内 抗氧化活性同改善记忆能力有相关性。 （3 ）采用超滤法对EHOP 进行纯化，得到组分A （＞10kDa）、组分B （10KDa～5kD ） 和组分C （5kDa ）三个组分，腹腔注射东莨菪碱建立急性学习记忆障碍模型，采用Morris 水迷宫考察了超滤组分对东莨菪碱所致学习记忆障碍的改善功能，并通过测定小鼠大脑中 MDA 含量、SOD 活性、MAO 活性和AchE 活性，初步探讨了其改善学习记忆机理。结果表 明：与模型组相比，各给药组小鼠潜伏期明显降低，其中H-组分B 和 L-组分C 对实验小鼠 的空间学习能力提高效果较为明显；空间探索试验中，H-组分B 和H-组分C 对东莨菪碱致 记忆障碍小鼠的记忆保持能力有一定的改善作用。与模型组相比，高、低剂量的组分B 和组 分C 均能显著降低小鼠大脑中的MDA 含量（P0.05 ），而仅H-组分A 组的SOD 活力显著提 高（P0.05 ），其余各组没有显著差异（P0.05 ）；与模型组相比，各给药组的AChE 活力显 著性降低（P 0.05 ），且与阳性对照组相比没有现在差异（P 0.05 ）；相对于模型组，仅L- 组分A 组、H-组分A 和L-组分C 组的MAO 活力显著降低（P 0.05 ），其余各组均作用不显 著（P0.05 ）。 I （4 ） 采用凝胶层析法对组分C 组分进一步分离纯化；以低分化的PC12 细胞及H O 2 2 损伤的PC12 细胞模型作为研究对象，显微镜观察EHOP 、组分C 及分离组分P1 、P2 、P3 、 P4 对PC12 细胞的生长增殖、分化的影响，采用MTT 法测定其存活率，研究EHOP 及其分 离组分对氧化损伤细胞的修复和保护作用。结果如下：Sephadex G-25 的分离条件为：超纯水 作流动相，流速1.0ml/min，上样量0.5ml，柱压0.03MPa ；组分C 分离可得到四个组分，其 中P3 含量最高。高剂量组（800ug/mL）和低剂量组（400ug/mL ）的EHOP 和P3 均能显著提